目的与意义:表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)是人表皮受体(Human Epidermal Receptor,HER)或Erb B家族的成员之一,也是酪氨酸激酶受体超级家族的一员,目前已成为多类恶性肿瘤(胃癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、头颈癌和结直肠癌等)治疗的热门靶点之一。针对受体分子胞外域的单克隆抗体和胞内域的小分子酪氨酸激酶抑制剂是目前抗HER治疗的主要靶向药物类型,但已上市药物普遍存在临床反应率低、耐药性等问题。HER家族受体分子表面和胞内域广泛存在的遗传性、病理性突变以及家族受体间的异源二聚化是该类靶向治疗药物获得性耐药的二个主要原因,而靶向结构上高度保守、并直接参与受体二聚化的EGFR二聚化界面则有可能解决抗EGFR治疗的耐药问题。本实验室前期研究曾采用来自EGFR二聚化界面直接参与二聚化的β-环多肽EGFR237-267做抗原,构建或筛选了靶向EGFR二聚体界面的多肽疫苗、单克隆抗体(monoclonal antibody,m Ab)和纳米抗体(nanobody),并通过体内外抑瘤实验初步证明了EGFR二聚化界面靶向策略的可行性。纳米抗体(nanobody)亦称单域抗体(single domain antibody,sd Ab)或重链单域抗体(variable domain of the heavy chain of heavy-chain antibody,VHH),来自羊驼和鲨鱼的重链抗体的可变区,分子量约15 k Da,具有良好的理化稳定性和组织穿透能力,可以利用微生物基因工程系统高效生产,在研制廉价高效的治疗性抗体和检验试剂方面具有良好的应用前景,但其血清稳定性远不如单抗,体内半衰期短,另外也不具备单抗那样的ADCC作用(抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用,antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)。目标纳米抗体与抗人白蛋白的纳米抗体偶联后可在体内与人血白蛋白(human serum albumin,HSA)结合而受到白蛋白的保护,提高半衰期,而靶向自然杀伤细胞(natural killer,NK)表面的Fc受体FcγRIIIa(CD16)的纳米抗体则可赋予纳米抗体的ADCC作用。本研究拟构建一类具有较高血清稳定性的、既具有抗EGFR二聚化功能又具备ADCC作用的、由靶向EGFR二聚体界面、NK细胞Fc受体FcγRIIIa(CD16)和HSA三种纳米抗体组成的纳米抗体,并系统考察其体外血清学稳定性和体外体内的抑瘤活性。为进一步研发靶向EGFR二聚体界面的治疗性纳米抗体药物打下坚实基础。纯化产物以人表皮癌A431细胞和人肺癌NCI-H292细胞为靶细胞,采用流式细胞术分析双特异性抗体与细胞表面EGFR的特异性结合能力,证实双特异性抗体对过表达EGFR细胞是否呈剂量依赖性结合效果。观察双特异性抗体单独用药和与PBMCs联用对EGFR阳性肿瘤细胞的杀伤作用,同时与单一纳米抗体进行比对,验证双特异性抗体是否对肿瘤细胞存在细胞毒效应。以人表皮癌A431细胞为移植瘤细胞,进行裸鼠荷瘤实验,验证双特异性抗体与对照单一纳米抗体在体内的肿瘤杀伤作用;免疫组化法检测双特异性抗体与对照的单一纳米抗体在体内的定向穿透肿瘤组织能力,验证双特异性抗体的组织穿透能力。为进一步研发靶向EGFR二聚体界面的治疗性抗体打下基础。研究内容与方法:1.双特异性纳米抗体的构建、表达与纯化1.1抗体设计双特异性抗体(TSsd Ab)采取sd Ab EGFR-(G4S)3-sd Ab HSA-(G4S)3-sd Ab FcγRIIIa-His6模式,其中sd Ab EGFR为本实验室从一种非免疫人源化纳米抗体噬菌体展示库筛选到的靶向EGFR二聚体界面的纳米抗体,即上述EGFR dimer Nb77;sd Ab HSA和sd Ab FcγRIIIa分别为文献报道的抗人白蛋白和抗FcγRIIIa的纳米抗体;(G4S)3为柔性接头,为3个串联重复的Gly-Gly-Gly-Ser序列;His6为亲和层析标签,为6个His连续序列。1.2表达系统构建与小规模制备通过基因工程手段获取目的基因表达载体,用限制性内切酶Xho I、Xba I酶将扩增的目的基因与提取的质粒进行双酶切、连接,组合质粒转移到毕赤酵母X-33,SDS-PAGE和Western blot技术对毕赤酵母X-33工程菌的表达产物进行分析,用CM Sepharose column、Ni-NTA column亲和层析纯化。采用人工合成法获得目的基因,采用毕赤酵母-X33分泌型表达系统构建工程菌,表达载体为p GAPzαA,为GAP启动子驱动的组成型分泌表达载体,目的基因按毕赤酵母偏爱密码子设计、并与α因子信号肽融合后人工合成,克隆于Xho I与Xba I之间。表达载体线性化后电转化法转化宿主细胞,博来霉素筛选高抗性整合子,再在其中筛选高表达重组子。工程菌采用YEPD培养基摇瓶培养72 h,离心取上清经CM Sepharose column、Ni-NTA column亲和层析二步法模纯化,SDS-PAGE和Western blot鉴定和分析表达产物。2.双特异性纳米抗体体外血清稳定性与特异性结合能力分析体外实验2.1血清稳定性分析抗体与人血清37℃孵育不同时间后取样进行Western blot分析,比对不同时间点样品中纳米抗体阳性带的大小,以评估抗体在体外环境的稳定性。2.2与过表达EGFR的肿瘤细胞表面特异性结合能力分析使用不同浓度的双特异性抗体作用于过表达EGFR的人表皮癌A431细胞和人肺癌NCI-H292细胞,流式细胞术检测双特异性抗体与细胞表面EGFR的特异性结合能力。2.3体外抑瘤活性和ADCC效应分析MTT法比对观察双特异性抗体与单一的纳米抗体EGFR dimer Nb77对EGFR同源二聚体和异源二聚体表型肿瘤细胞的体外杀伤作用。比对观察抗体单独和与PBMCs联用对EGFR阳性肿瘤细胞的杀伤作用,以评估双特异性抗体的ADCC效应。3.裸鼠移植瘤模型实验3.1体内抑瘤活性观察比对观察纳米抗体与西妥昔对EGFR表型肿瘤细胞裸鼠移植模型的实验疗效。右前侧皮下注射肿瘤细胞,尾静注射脉新鲜的人PBMC细胞,腹腔注射抗体或生理盐水(NS)对照,随后每隔2天,连续6次腹腔注射抗体或盐水,测定裸鼠体重和瘤体积。3.2免疫组化法检测抗体组织穿透性结束体内抑瘤实验,活体分离移植瘤组织,4%多聚甲醛固定,制作石蜡切片,以抗His Tag mouse m Ab为一抗,免疫组化法检测双特异性抗体的组织穿透性。结果:1.双特异性纳米抗体的构建、表达与纯化重组质粒转化至E.coli DH5α,经检测与所设计基因序列的完全一样,得到的阳性转化子命名为:NK-77-p GAPZα-A-X-33。重组子NK-77-p GAPZα-A-X-33质粒成功转化至毕赤酵母X-33,获得自分泌型毕赤酵母X-33高效表达株。表达产物经阳离子交换、镍柱亲和层析二步纯化,蛋白纯度达到90%以上。表达产物命名为EGFR-HSA-CD16。2.双特异性纳米抗体的血清稳定性抗体与人血清体外37℃孵育结果显示,EGFR dimer Nb77纳米抗体在与血清孵育72h后出现蛋白杂带,初步推断为蛋白降解所致。EGFR-HSA-CD16双特异性抗体与血清孵育72h、168h后Western blot结果未见蛋白杂带,表明血清中的稳定性达到了7天以上,但最终的半衰期尚需进一步持续观察确定。3.双特异性纳米抗体与细胞表面EGFR的特异性结合能力检测的双特异性抗体EGFR-HSA-CD16对人表皮癌A431细胞、人肺癌NCI-H292细胞具有特异性结合活性,而且随着抗体浓度的增加,特异性结合信号越强,呈现剂量依赖性。4.双特异性纳米抗体体外抑瘤活性与ADCC作用在没有PBMCs时,双特异性纳米纳米抗体EGFR-HSA-CD16和单特异性纳米抗体EGFR dimer Nb77对A431和NCI-H292细胞的体外抑制活性相似,抑制率介于30-40%,显著高于阳性对照单克隆抗体西妥昔的(约20%)。与PBMCs共孵育时,双特异性抗体EGFR-HSA-CD16相比EGFR dimer Nb77对人表皮癌A431细胞的抗增殖作用有一定的增强,表明其存在ADCC效应。5.双特异性纳米抗体的体内抑瘤活性与组织分布人表皮癌A431裸鼠移植瘤模型实验结果显示,西妥昔(Cetuxi)、EGFR dimer Nb77、EGFR-HSA-CD16和EGFR-HSA-CD16+PBMCs四种给药模式的抑瘤率分别为99.62%、62.53%、30.90%和53.22%,并且三种抗体均可有效到达移植瘤部位,但抗体阳性信号强度差别不大,均在35%左右。结果表明二种纳米抗体均可在体内有效抑制A431移植瘤的生长,但与体外抑瘤实验结果不同,二者的体内抑瘤活性显著低于西妥昔的。西妥昔对A431的抑制率显著高于大多数单抗类药物的移植瘤模型所测抑制率,其奇高的抑制率可能与西妥昔是直接抑制EGF与EGFR的结合有关,而A431是野生型EGFR成千倍地过表达的细胞。双特异性纳米抗体与PBMCs联用时的抑制率高于单独使用时的,进一步表明该抗体存在ADCC效应,而双特异性抗体二个组的抑制率均低于单特异性纳米抗体的,可能与双特异性抗体分子尺寸增大3倍后组织穿透率和真实的肿瘤组织分布下降有关。结论:成功构建了一种靶向EGFR二聚化界面的人源化的双特异性纳米抗体,该抗体具有良好的血清稳定性,并具有良好的体内外抑瘤活性,为进一步研发靶向EGFR二聚体界面的治疗性纳米抗体打下了良好基础。