血红蛋白(Hemoglobin,Hb)是一种红细胞蛋白,属于珠蛋白超家族成员之一,通过将氧气从呼吸交换表面传输到呼吸组织的细胞中,血红蛋白在维持有氧呼吸时起到重要作用。除了参与有氧代谢外,研究表明Hb还参与一氧化氮的代谢且具有抗菌作用。在有颌类中,Hb是由两个α亚基和两个β亚基组成的四聚体蛋白,而编码这两种亚基类型的基因起源于有颌脊椎动物共同祖先的一次基因串联重复事件。血红蛋白基因家族演化研究发现,编码这两种亚基的基因分布在脊椎动物的三个基因座上,它们分别为MN、LA和DS基因座(Hb基因上下游共线基因首字母缩写)。脊椎动物作为脊索动物亚门中,数量最多,形态结构最复杂,演化地位最高的一个类群,具有完善的氧循环及代谢系统。目前,关于Hb基因家族演化的研究主要集中在脊椎动物单一物种或单一类群中,而在整个脊椎动物中的研究则比较匮乏,血红蛋白基因家族在整个脊椎动物中的演化情况是怎样的仍亟需解决。同时,在Hb基因家族的研究中,基因转换(Gene conversion)对Hb基因的同源关系鉴定也提出了挑战,目前相关研究仅限于哺乳类和鸟类,其他类群则没有报道,因此我们使用CHAP2(The Cluster History Analysis Package)对脊椎动物进行基因转换分析。此外,本文广泛选取了97种脊椎动物(包括1种无颌类,6种软骨鱼类,1种肉鳍鱼类,30种辐鳍鱼类,7种两栖类,11种爬行类,16种鸟类以及25种哺乳类)进行Hb基因的鉴定、比较基因组学及演化分析,获得了较为全面和系统性的比较基因组学分析结果,为Hb基因在脊椎动物基因组中的分布提供了较为完整的视图,进而获取有生物学意义的规律,主要研究结果如下:1、脊椎动物Hb基因家族成员的鉴定及在各物种基因组中的分布为了准确的鉴定脊椎动物基因组中的Hb基因序列,我们进行同源预测并使用Blast2 v2.2验证。通过对所获取的序列进行统计和分类,我们最终在97个脊椎动物基因组中鉴定出879条Hb基因序列。其中,爬行类和鸟类的Hb基因家族成员数差异较小,大多数物种含7个Hb基因家族成员,而哺乳类Hb基因家族成员数从2个(霍氏树懒,Choloepus hoffmanni)到14个(山羊,Capra hircus)不等,差异较大。相对于其他四足类,两栖类中除双条吻蚓(Rhinatrema bivittatum)外,Hb基因的家族成员数较多(约12个Hb基因家族成员)。在鱼类中,不同类群表现出较大的差异。与其它鱼类相比,鲀形目中的红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)、青斑河鲀(Tetraodon nigroviridis)以及四种鲈形目的弹涂鱼,大弹涂鱼(Boleophthalmus pectinirostris)、大鳍弹涂鱼(Periophthalmus magnuspinnatus)、齿弹涂鱼(Periophthalmodon schlosseri)和青弹涂鱼(Scartelaos histophorus)的Hb基因家族成员数相对较少(约4个Hb基因家族成员),而脂鲤目中的墨西哥丽脂鲤(Astyanax mexicanus)、纳氏锯齿鲤(Pygocentrus nattereri)(约20个Hb基因家族成员)和狗鱼目中的白斑狗鱼(Esox lucius)的Hb基因家族成员数相对较多(约30个Hb基因家族成员)。通过共线性及同源性分析,结合CHAP2分析结果可知这三种鱼类中Hb基因的加倍是由不同的基因复制机制导致,除了真骨鱼类特有的一次全基因组复制(Fish Specific Genome Duplication,FSGD)外,还包括长片段的基因复制与基因串联重复。2、脊椎动物Hb基因家族成员的结构特征分析通过脊椎动物Hb基因的保守基序(Conserved motif)及基因结构(Gene structure)预测结果表明,大部分脊椎动物Hb基因含有9个基序(除西部锦龟(Chrysemys picta)HBA基因只含有6个基序而斑点雀鳝(Lepisosteus oculatus)hba基因含有8个基序)。与有颌类相比,圆口类Hb基因含有特殊的基序motif5、motif7和motif9,这与之前认为圆口类Hb基因是独立演化的研究结论相吻合。另外,根据预测结果显示,矛尾鱼(Latimeria chalumnae)的三个基序片段:片段1(包括Motif4、Motif6及Motif2)、片段2(含Motif2和Motif1)及片段3(Motif3和Motif2)发生重复,并且产生了更长的蛋白编码区(CDS)。同时,基于基因结构预测结果显示,大多数脊椎动物Hb基因主要由2个内含子(Intron)和3个外显子(Exon)构成,除人类(Homo sapiens)的HBZ和HBQ基因只存在两个外显子区和一个内含子区以及矛尾鱼存在9个外显子区和8个内含子区,表明Hb基因结构在不同脊椎动物类群中较为保守。3、脊椎动物Hb基因家族的共线性特征分析共线性分析结果显示,所有脊椎动物Hb基因上游都存在NPRL3基因,表明圆口类和有颌类脊椎动物的Hb基因来源于脊椎动物最近共同祖先的一次全基因组复制(Whole Genome Duplications,WGD)。在真骨鱼类中,共线性分析结果表明位于LA基因座的Hb基因是由FSGD产生。在两栖类中,两栖类的Hb基因位于两个不同的染色体片段上,一条染色体上存在α/β珠蛋白基因,另一条染色体上存在多个β珠蛋白基因。在羊膜动物中,尽管β珠蛋白基因经历了一次基因转移(Gene transpose)事件,然而羊膜动物的Hb基因共线性较鱼类及两栖类保守。结合矛尾鱼Hb基因在染色体片段上的分布可知,羊膜动物的β珠蛋白基因来源于MN基因座上的祖先β珠蛋白基因。4、脊椎动物Hb基因家族的演化速率分析在进行演化速率分析时,我们采用基于最大似然法的软件PAML v4.9计算脊椎动物各类群Hb基因的dN/dS。结果显示,真骨鱼类在经历一次额外的基因组复制事件以后,位于不同基因座的Hb基因拥有不同的演化速率,MN基因座的Hb基因拥有比LA基因座Hb基因更高的演化速率。同时,我们发现在羊膜动物中,α珠蛋白基因的dN/dS值相对较低,且鸟类的α珠蛋白基因的dN/dS值最低;与没有发生过基因转移的α珠蛋白基因相比,发生过一次基因转移的β珠蛋白基因拥有较高的演化速率。因此,我们推测在羊膜动物Hb基因演化过程中,β珠蛋白基因较高的演化速率可能与其发生的一次基因转移事件存在某种联系。5、脊椎动物Hb基因家族的X-orthology与N-orthology分析通过对不同脊椎动物类群的Hb基因使用CHAP2进行基因转换分析发现,羊膜类的β珠蛋白基因受到较多基因转换的影响,而在辐鳍鱼类及两栖类中,Hb基因家族都没有受到基因转换事件的影响,结合Hb基因家族成员鉴定、演化路径,基因转换可能更倾向于发生在血红蛋白基因家族成员数相对较少的羊膜类动物中。在哺乳类中,β珠蛋白基因比α珠蛋白基因受到更多的基因转换事件的影响,且基因转换更多的发生在HBB与HBD基因之间。同时X-orthology与N-orthology的分析结果都表明在哺乳类中,α珠蛋白基因(HBAT1、HBAT2和HBAT3)出现较高的的基因嵌合;相对于哺乳类,鸟类中血红蛋白基因嵌合较少,并且根据CHAP2分析结果显示嵌合复杂性低于哺乳类。在鸟类α珠蛋白基因中没有出现基因转换,而在鸟类的两个胚胎β珠蛋白基因(ε和ρ)中出现率较高。与之前的研究相比,我们发现鸟类的成体β珠蛋白基因(β~H和β~A基因)也出现较多的基因转换。在爬行类中,基因转换事件对爬行类的影响与鸟类相似,爬行类α珠蛋白基因中没有发现基因转换,而β珠蛋白基因中出现率较高。总之,本文通过对97种脊椎动物基因组中Hb基因的鉴定、含量及特征分析,丰富了Hb基因家族的基础数据。通过比较基因组学分析,确定了脊椎动物Hb基因的结构、共线性和演化速率等特征;此外,我们还针对基因转换事件造成的Hb基因之间同源性关系紊乱问题作了进一步分析,探讨了基因转换在演化过程中的作用及影响,为后续Hb基因的深入分析奠定了基础。