论文部分内容阅读
目的:肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之?,超过80%是非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC）,靶向治疗对于NSCLC的疗效也最值得关注。近年来,以表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR）为靶点的酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine Kinase Inhibitor,TKI）已成为非小细胞肺癌,尤其是手术受限的晚期肺癌患者的靶向治疗策略。虽然具有EGFR突变的非小细胞肺癌患者可以从EGFR-TKIs治疗中明显获益,但其用药过程中产生的耐药现象影响了靶向药物疗效。研究EGFR-TKIs获得性耐药机制已成为肺癌分子靶向治疗领域内的热点问题。p120-catenin（p120ctn）属于Armadillo基因家族成员,通过调控E-cadherin/catenin复合体的稳定性和Rho GTPases的活性,影响肺癌细胞的增殖、侵袭和转移。近期研究结果显示p120ctn还具有调节EGFR信号通路的重要功能,提示我们p120ctn可能参与肺癌细胞的EGFR-TKIs耐药机制,但目前尚缺乏相关研究资料。因此,阐明p120ctn对非小细胞肺癌EGFR-TKIs获得性耐药的调控机制,将为寻求新的联合治疗靶点,提高临床肺癌靶向治疗的疗效提供理论基础和科学依据,对克服临床耐药的发生,延长患者的生存时间,提高患者的生存质量具有重要的意义。研究方法:首先,我们通过免疫组化检测了具有EGFR基因突变,并接受EGFR-TKIs（吉非替尼）治疗的170例肺腺癌患者（外显子19缺失81例,外显子21的L858R点突变89例）,并随访其疗效2年后,分析p120ctn的表达改变与EGFR-TKIs疗效间的关系。同时应用体外浓度梯度递增（0.1～1μM）的诱导方法建立吉非替尼获得性耐药的肺癌细胞系“Hcc827-GR”,应用Western blot检测吉非替尼耐药细胞系“Hcc827-GR”中p120ctn表达部位是否改变;由此明确p120ctn的异位表达与非小细胞肺癌EGFR-TKIs获得性耐药的关系。然后我们应用免疫组化和Western blot方法检测182例具有随访资料的原发性肺鳞癌、腺癌标本中P21活化激酶（p21-activated kinase,PAK）Group I的表达模式;应用Western blot在人正常支气管上皮细胞系HBE,人类肺鳞癌细胞系（SK-MES-1,LK-2）,人类肺腺癌细胞系（NCI-H1299,A549）中检测PAK Group I的表达情况;同时使用MTT、流式细胞术等方法,检测在PAK Group I抑制剂（IPA3）作用下,肺癌细胞的改变,探讨PAKs活性是否能够影响肺癌细胞对EGFR-TKIs的敏感性,由此明确非小细胞肺癌中PAK Group I的表达情况、临床意义,以及PAKs活性对肺癌细胞对EGFR-TKIs敏感性的影响。最后,我们通过免疫组化检测检测肺癌组织中p120ctn和Y335位点磷酸化的p120ctn表达的相关性,明确p120ctn的Y335位点磷酸化是否是导致p120ctn出现异位表达的原因;使用Western Blot等方法,检测吉非替尼对PTP-PEST的蛋白表达水平的影响,及由此对p120ctn Y335位点的磷酸化和p120ctn表达定位的影响;应用Real-time RT-PCR、Western Blot、GST pull-down、MTT、Transwell等方法,检测肺癌细胞系HCC827、H3255中,p120ctn的异位表达对Cdc42/Rac1、PAKs家族成员、EGFR下游ERK/AKT信号通路活性的影响,探讨p120ctn异位表达促进肺癌细胞对EGFR-TKIs产生获得性耐药的机制。结果:1、与p120ctn正常表达的患者相比,在p120ctn出现异位表达的病例中EGFR-TKIs的效果比较差,患者更容易在短期内出现获得性耐药（P<0.05）;与吉非替尼敏感细胞系Hcc827相比,其耐药细胞系Hcc827-GR中,p120ctn的胞浆表达明显上调,胞膜表达明显下降。2、在正常的肺组织中,PAK group I为弱表达或不表达,在肺癌组织中,有68.13%的样本出现胞浆的过表达。PAK group I的过表达与肺癌患者的组织学类型（p=0.003）,高TNM分期（p=0.015）,淋巴结转移（p=0.024）和患者的不良预后显著相关（p=0.017）。IPA3和吉非替尼虽然能在不同程度上抑制肺癌细胞的增殖,但与单独使用IPA3或吉非替尼相比,二者的联合应用能够明显抑制肺癌细胞的增殖,使S期细胞显著减少和G1期细胞显著增多。3、p120ctn出现胞浆异常表达的肺组织和细胞系中,p120ctn Y335位点的磷酸化水平明显上调;蛋白酪氨酸磷酸酶（Protein-tyrosine-phosphatase,PTP-PEST）的表达下调可通过增强p120ctn Y335位点的磷酸化,导致p120ctn出现细胞质的异常表达。在p120ctn出现异常表达的肺癌细胞系中,磷酸化的AKT/ERK表达水平明显上调,PAK1、PAK2、PAK4和PAK6的活性均出现不同程度的增强。PAK1/PAK4表达减弱后,异常表达的p120ctn激活ERK/AKT的能力显著减弱;下调PAK2后,异常表达的p120ctn激活ERK的能力显著减弱,但仍然能够激活AKT;下调PAK6后,异常表达的p120ctn激活ERK/AKT的能力没有明显改变。p120ctn的异位表达还能够明显增强Cdc42/Rac1的活性,并且增强肺癌细胞的侵袭能力;在Cdc42/Rac1抑制剂作用下,异位表达的p120ctn对磷酸化的PAK1,PAK2,PAK4和PAK6的表达没有明显的增强作用,同时p120ctn异位表达的肺癌细胞对吉非替尼的敏感性也有所增强。结论:1、p120ctn的胞质异位表达与肺癌患者对EGFR-TKIs产生获得性耐药显著相关。2、PAK group I的过表达在肺癌对EGFR-TKIs形成耐药的过程中起重要作用;在对吉非替尼敏感性不高的肺癌细胞中,联合IPA3的应用,能够明显提高肺癌细胞系对吉非替尼的敏感性。3、肺癌组织中,p120ctn Y335位点的磷酸化可能是p120ctn出现胞浆异常表达的主要原因之一。4、吉非替尼治疗后,EGFR下游ERK信号通路的活性被抑制,由此减弱了PTP-PEST结构的稳定性,下调了PTP-PEST的蛋白表达,进而削弱其对p120ctn Y335位点的去磷酸化作用,促进p120ctn Y335位点的磷酸化,导致p120ctn在TKI作用后从胞膜解离进入细胞质。5、在胞浆出现异位表达的p120ctn通过激活Cdc42/Rac1,活化其下游PAKs家族不同成员,从而激活EGFR下游ERK/AKT的活性,使EGFR-TKIs有作用而无效果,进而促进肺癌细胞对EGFR-TKIs产生耐药。因此,明确p120ctn的表达改变将有助于筛选肺癌患者中更适用于接受EGFR-TKIs靶向治疗的敏感人群,以更好的实现非小细胞肺癌个体化治疗。