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随着社会的进步和人口的老龄化,冠心病、脑卒中等心脑血管疾病已成为威胁人类健康的主要杀手。作为心脑血管疾病共同病理基础的动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS),一直是人们研究心脑血管疾病发病机制和寻找有效防治措施的突破口。AS病因绝非一种因素所致,可能为多种因素联合作用的结果。这些危险因素参与AS的发病机制尚未完全明了。近年来提出,动脉粥样硬化可能是一种多因素引起的炎症反应。内皮通透性增加和血浆脂蛋白(主要是低密度脂蛋白—LDL)水平增高,使脂蛋白易于渗透到内皮下,是AS发展过程中的主要特征之一。其中与发病关系最密切的是Ox-LDL。普遍认为血浆中的LDL通过内皮屏障进入动脉壁,滞留于内皮下层,成为各种修饰的LDL,Ox-LDL刺激相邻的内皮细胞产生致炎信号,释放各种化学刺激剂和细胞因子,如VEGF、M-CSF和MCP-1;使循环单核细胞进入动脉壁,分化为巨噬细胞表达大量的清道夫受体(scavenger receptor,SR),通过清道夫受体无限制摄取氧化修饰的低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,Ox-LDL),导致脂质过氧化物的形成,从而转化为单核/巨噬细胞源性泡沫细胞;这些因子进一步激活平滑肌细胞(SMC)使之合成细胞外基质,引起SMC迁移和增殖,纤维组织形成,这种过程反复发生,最终形成AS斑块。从体内AS病灶中得到的修饰LDL,其性状类似与体外LDL用铜离子氧化所得到的Ox-LDL。因此我们以铜离子氧化得到的Ox-LDL刺激单核/巨噬细胞-内皮细胞共培养系统,研究其对内皮细胞功能的影响及其信号转导机制。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是迄今为止发现的唯一促进血管内皮细胞有丝分裂作用的生长因子,并是唯一具有增加血管通透性作用的生长因子。Williams B.等认为,VEGF通过旁分泌形式作用于内皮细胞,使血管内皮细胞通透性升高,促进了AS的形成。Src酪氨酸激酶家族与细胞内多条信号转导途径有关,其相关基因参与许多重要的生理过程,如生长、分化、黏附、转录等,有研究表明, Src家族酪氨酸激酶信号转导途径参与VEGF的血管生成作用。因此,进一步从分子水平研究Src途径在VEGF引起的内皮通透性增加过程中的作用,对于阐明VEGF促进<WP=9>AS形成的机制具有重要意义。本课题设计建立的内皮/巨噬细胞共培养模型,可以较好的模拟体内的生理情况。应用该药理模型,首先在GEArrayTM Q内皮细胞功能芯片上研究了Ox-LDL刺激下单独培养的内皮细胞与单核-内皮细胞共培养系统中内皮细胞基因表达的差异;并进一步研究了Src家族酪氨酸蛋白激酶信号转导途径对VEGF促内皮细胞Ox-LDL通透性升高的影响,旨在进一步阐明VEGF在AS形成中的机制。第一部分 Ox-LDL刺激单核/内皮细胞共培养系统对内皮细胞功能的影响单独培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)与单核(U937)细胞/内皮细胞共培养系统用Ox-LDL(40 mg/L)刺激24h后,用Trizol提取总RNA。取5ulRNA溶液,稀释100倍,测量其260nm和280nm下的光吸收值,以此计算260/280比值以及溶液浓度。取总RNA 5μg,用SupurArray公司的GEArrayTM Q系列人内皮细胞生物学功能基因芯片来分析单独培养内皮细胞与共培养系统中内皮细胞在ox-LDL刺激下基因表达的差异,并通过RT-PCR方法对其中部分基因进行验证。Ox-LDL刺激内皮细胞基因表达量与空白对照组相比,大于3为表达上调,小于0.33为下调。结果显示:(1)Ox-LDL刺激单独培养的内皮细胞与空白对照组相比,基因表达有31个上调,20个下调;上调显著基因主要有ICAM2、3,VEGF受体1、2,FGF2,IL-11、14、15,ICE等与细胞生长分化及炎症反应相关的基因以及MMP14、2、9、eNOS等与内皮细胞血管屏障功能相关的基因;下调的基因主要有ACE,ACE2,EDN3,EDNRA、B,CASP10,BCL2等与细胞凋亡及诱导血管收缩的基因。(2)Ox-LDL刺激共培养系统后,内皮细胞与空白对照组相比,基因表达上调有40个,下调的有10个。上调的主要是与细胞凋亡及血管收缩相关的基因,如CASPASE1、3、6,ACE,ACE2,END1、2、3,END受体A、B;与炎症及血管屏障相关基因,如IL-14、15、1β、3,MMP1、2等。下调基因包括选择素L,VCAM1,VEGF受体1、3等。(3)Ox-LDL刺激下,共培养系统中内皮细胞与单独培养的内皮细胞相比,基因表达上调23个,下调21个。上调的主要有ACE,ACE2,VEGF受体KDR,MMP,E选择素等。下调的主要有VEGF受体1、3,内皮素1、2,MMP2、9、14等。上述芯片结果,我们通过RT-PCR对部分主要基因进行了验证。 <WP=10>我们通过ELISA实验还发现, Ox-LDL刺激下共培养系统中VEGF蛋白表达量显著高于单独培养的内皮细胞。第二部分 Src酪氨酸激酶信号转导途径在VEGF诱导内皮细胞对Ox-LDL通透性升高中的作用按现代生物学的观点,多细胞组织间的协调功能由各组成细胞间的相互作用及对外界环境改变的适时反应所决定。细胞信号转导机制是一非常复杂的过程,尽管关于这方面的研究很多,但可得的资料仍非常有限。原癌基因Src是第一个被鉴别出可诱导细胞转化的基因,有研究表明, Src家族酪氨酸激酶参与VEGF诱导的血管生成作用;丝裂原活化蛋白激酶(mitogen—activated protain kinase,MAPK)信号通路是近年来发现广泛存在于各种动物细胞中的一条信号转导途径,对于细胞周期的运行和基因表达具有重