本课题组在前期的工作中筛选出一株巧克力微杆菌SIT101,它所产的酯酶能够不对称催化生物素中间体二甲酯生成(4S,5R)-单甲酯,产率和e.e值分别大于95%和99%。它是D-生物素全合成过程中的一种重要的中间体,具有极大的工业应用价值。目前,课题组前期工作中已经对微杆菌重组酯酶进行大肠杆菌基因工程菌的构建,并完成了对该重组菌在诱导剂IPTG诱导下的发酵优化(摇瓶水平)。本课题将继续对该菌的发酵过程进行系统而深入的研究,探寻一条低成本且适合工业化应用的微杆菌重组酯酶E.coli BL21(DE3)-p ET-21a-estsit01的发酵工艺。与此同时还对大肠杆菌重组酯酶整细胞的固定化技术进行了研究。论文的第一部分,对该重组大肠杆菌进行5L发酵罐分批发酵优化实验,研究了诱导剂浓度、初始诱导点、诱导温度及初始p H值对发酵产酶的影响。在最佳条件下,细胞发酵在12h酶活达到最大,为3886.0 U/L,此时OD600为26.29,比酶活为382.9 U/g论文的第二部分,采用了单因素方法优化了微杆菌重组酯酶在大肠杆菌中的自诱导表达条件,包括培养基成分、培养条件及诱导条件三个方面。经发酵优化后,自诱导培养基发酵出来的菌体浓度(3.7 g/L)和单位体积发酵液产生的酶活力(1654.7 U/L)与经IPTG诱导的初始培养基(菌体浓度2.35 g/L,酶活1072.7 U/L)相比都提高了约1.5倍。生产1KU的重组酯酶,消耗的培养基成本按照AR级试剂价格来计算约为3.8元,按工业级试剂价格计算约为0.45元,与课题组前期优化的IPTG诱导发酵培养基成本相比,降低了35%。论文的第三部分,对含有酯酶的大肠杆菌整细胞固定化技术进行了研究,比较几种常见的固定化方法,选择交联剂戊二醛对细胞进行固定化,可以保留61%相对酶活。对固定化细胞的反应条件进行优化。最终结果为:戊二醛终浓度5%,交联时间90 min,交联缓冲液为PB(p H=7)溶液。对固定化细胞和游离细胞酶学性质进行研究发现,固定化细胞在p H 6-10及温度30℃-60℃下与游离细胞相比表现出优良的稳定性。固定化细胞在重复使用16次之后仍有100%的转化率,且在4℃下储藏30天后仍有40%的残余酶活。