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第一部分 高脂多糖合并低氧特征的严重感染患者外周血T细胞分化相关基因表达特点
目的：探讨高脂多糖合并低氧特征的严重感染患者外周血T细胞分化相关基因表达特点
方法：回顾性分析东南大学附属中大医院重症医学科临床数据库中符合社区获得性严重感染诊断的病例资料，根据入院时血浆脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）水平及氧合指数(Partial Pressure of Oxygen/ Fraction of inspiration O2 ， PaO2/FiO2, P/F ）进行分组：LPS>10pg/ml且P/F≤200mmHg为高LPS合并低氧组，LPS≤10pg/ml且P/F>200mmHg为对照组,记录基本资料、感染部位及可能的致病菌、入组时合并的器官功能障碍、器官支持技术及支持条件(如是否存在急性肾损伤、是否需要肾脏替代治疗及条件等），病情严重程度评分如：序贯器官衰竭评估评分、急性生理和慢性健康评估Ⅱ评分，入院后24小时内免疫炎症指标（白细胞计数、淋巴细胞计数、降钙素原、超敏C反应蛋白、白介素-6），采用Human LncRNA Microarray V4.0芯片检测全血mRNA表达，利用NCBI、GO、STRING数据库对T细胞相关基因进行差异性表达分析及生物学功能富集及。
结果：①一般情况：高LPS合并低氧组纳入9例，对照组纳入6例。高LPS合并低氧组患者血浆 LPS 水平显著高于对照组（ 66.25[16.05,97.48] vs. 5.00[5.00, 6.38] pg/ml, P=0.003），高LPS合并低氧组患者P/F显著低于对照组(129±62 vs. 346±55 mmHg, P＜0.001 ）；②疾病严重程度与器官功能损伤：高 LPS 合并低氧组患者肌酐水平 （164[79,332] vs. 60[55,105] umol/L, P=0.017）、乳酸水平（2.2[1.5,3.4] vs. 1.2[0.8, 2.0] mmol/L, P=0.039）显著高于对照组组，其SOFA评分更高（11±4 vs. 7±1, P=0.046），提示高 LPS 合并低氧特征患者病情严重程度更重; ③免疫炎症指标:与对照组组比较，高LPS 合并低氧组患者外周血淋巴细胞水平显著降低（ 0.4[0.3,0.6] vs. 0.8[0.5,1.2] /μL, P=0.020），中性粒细胞与淋巴细胞计数比值显著上升（17.9[7.1,23.4] vs. 6.8[2.9,12.3], P=0.050）,全身性炎症指标（体温、心率、呼吸频率、白细胞计数）、外周血降钙素原、超敏C反应蛋白、白介素-6水平无明显差异；④低氧信号通路：外周血芯片检测提示差异性基因在低氧信号通路存在富集，高 LPS 合并低氧组患者外周血细胞低氧反应相关基因表达显著上调（P<0.05）; ⑤T细胞分化相关基因表达分析：与对照组比较，高LPS合并低氧组Th17正向转录调控基因STAT3（P=0.006）及BATF（P=0.014），受体活化基因TLR2及细胞因子及其受体相关基因FABP5（P=0.016）及IL6ST（P=0.046）表达显著上调，Th17负向信号转导基因STAT5A（P=0.045）及PPARG（P=0.049）表达显著下调，提示分化为Th17表型的细胞增加；Treg功能相关基因TET3（P=0.004）表达显著下调，提示分化为Treg表型的细胞减少。
结论：高LPS合并低氧的严重感染患者疾病严重程度与器官功能损伤更重，外周血淋巴细胞降低更明显。其外周血细胞中Treg分化相关基因表达受抑，提示分化为Treg表型的细胞减少；Th17型分化相关基因表达增强，提示分化为Th17表型的细胞增加，导致Treg/Th17分化失衡。
第二部分 间充质干细胞处理对脂多糖-低氧诱导Treg/Th17分化失衡的影响
目的：建立 LPS-低氧诱导的 Treg/Th17 分化失衡体外细胞模型，探讨间充质干细胞（Mesenchymal stem cell, MSC）处理对Treg/Th17分化平衡的影响
方法：分离C57BL/6小鼠脾脏获得单细胞悬液，以磁珠纯化获得CD4+T细胞，予生理条件anti-CD3（5ug/ml）及anti-CD28（2ug/ml）活化刺激过夜，加入或不加入RAW264.7巨噬细胞（抗原提呈）进行单独或共培养。根据不同刺激条件分组：无刺激对照组，LPS （终浓度 0、10、100、1000ng/ml）刺激组，低氧（5%氧浓度）刺激组，LPS（不同浓度）-低氧共同刺激组。在LPS（100ng/ml）+低氧刺激条件下，通过transwell小室设置与MSC（鼠源性，Cyagen Biosciences, Inc.）直接共培养、间接共培养48小时，实施：①细胞样本Annexin V染色，流式细胞法检测T细胞存活率；②流式细胞法检测细胞样本中Treg、Th17亚群分化情况，以核染色CD25+Foxp3+鉴定Treg，以核内染色CD8-IL-17a+鉴定Th17细胞。
结果：①单纯 LPS 刺激对 CD4+T 细胞的影响：与无刺激对照组相比，LPS 刺激浓度10ng/ml组与100ng/ml组的CD4+T细胞存活比例、Treg分化比例均显著下降（均P<0.05）， Th17分化比例均显著升高（均P<0.05），LPS刺激浓度100ng/ml与1000ng/ml两组间CD4+T细胞存活比例、Treg分化比例、Th17分化比例均无差异；LPS刺激各组（10、100、1000ng/ml）中Treg/Th17比值均显著高于无刺激组（均P<0.001）；②单纯低氧刺激对 CD4+T细胞的影响：与无刺激组相比，低氧刺激组 CD4+T细胞存活无显著影响， Treg分化比例显著降低（P<0.05），Th17显著升高（P<0.05）；③LPS-低氧刺激对CD4+T细胞的影响：与无刺激组相比，在低氧基础上予各浓度 LPS 刺激，CD4+T 细胞存活、Treg分化比例均显著下降（均P<0.05），Th17分化比例均显著升高（均P<0.05），但低于各浓度LPS刺激组；与无刺激组相比，各浓度LPS合并低氧刺激时Treg/Th17比例均显著降低（均P<0.001）；LPS浓度为10ng/ml时，LPS-低氧刺激组Treg/Th17比值较单纯LPS刺激者（即LPS刺激浓度10ng/ml组）显著降低，其余浓度LPS刺激组与LPS-低氧刺激组的Treg/Th17 比值未见差异。④MSC 处理对 LPS-低氧刺激下 CD4+T细胞的影响：与LPS-低氧刺激组相比，MSC处理显著改善LPS-低氧刺激所致的Treg分化比例下降与Th17分化比例增加，使Treg/Th17比值升高（P<0.05），MSC直接处理或间接处理时Treg/Th17比值未见差异。
结论：LPS-低氧可诱导 Treg/Th17 分化失衡；MSC 处理可改善 LPS-低氧刺激所致的Treg/Th17分化失衡，该作用不依赖细胞直接接触机制。
第三部分 间充质干细胞调控脂多糖-低氧诱导Treg/Th17分化平衡的机制研究
目的：探讨MSC调控LPS-低氧刺激下Treg/Th17分化平衡的分子机制
方法：在 transwell 小室下层种植小鼠脾源性 CD4+T 细胞，上层加入 MSC（鼠源性， Cyagen Biosciences, Inc.）进行间接共培养，培养液中加入LPS（终浓度100ng/ml），置于5%O2低氧条件培养，以抗TGF-β1（10ug/ml）中和抗体明确MSC分泌的TGF-β1对Treg/Th17分化的影响；微小RNA（microRNA，miR）-155 mimic或mimic control转染CD4+T细胞4小时后移至tranwell小室，在LPS（100ng/ml）、5%O2低氧条件下与MSC间接共培养，48小时后实施：① 酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay， ELISA）检测培养液上清中促炎型细胞因子 IL-17A、INF-γ、IL-21 与抗炎型细胞因子TGF-β1、IL-10水平；②RT-PCR法检测miR-155、Tgfb1、Rorc、Foxp3及Ptpn2 mRNA表达状况；③流式细胞法检测细胞样本中 Treg、Th17 亚群分化情况，以核染色CD25+Foxp3+鉴定 Treg，以核内染色 CD8-IL-17a+鉴定 Th17 细胞；④细胞样本进行Annexin V/PI染色，流式细胞法检测CD4+T细胞存活率；⑤细胞样本进行CTV染色， 72小时后流式细胞法检测miR-155mimic/inhibitor转染后对CD4+T细胞增殖能力。
结果：①MSC 处理对 LPS-低氧刺激下培养液上清中细胞因子分泌的影响：与无 MSC处理相比，MSC处理培养液中TGF-β1、IL-17、IL-10分泌水平均显著升高（均P<0.05）；②抗TGF-β1阻断LPS-低氧刺激下MSC间接共培养对Treg/Th17分化平衡的影响：与MSC处理相比，抗TGF-β1抗体可明显抑制LPS-低氧刺激环境下MSC对Treg/Th17失衡的调控作用（P<0.05），即MSC增加Treg、降低Th17的作用消失；③MSC分泌TGF-β1对LPS-低氧刺激下CD4+T细胞miR-155表达的影响：LPS-低氧刺激可显著提高CD4+T细胞miR-155表达（P<0.05），与MSC未处理相比，MSC间接共培养处理可抑制CD4+T细胞miR-155表达，而抗TGF-β1可明显阻断MSC间接共培养对CD4+T细胞miR-155表达的抑制作用（P<0.05）；④miR-155转染对LPS-低氧刺激下MSC间接处理CD4+T细胞调控Treg/Th17分化平衡的影响：CD4+T过表达miR-155时，MSC间接处理对LPS-低氧诱导的Treg/Th17失衡的调控作用受到抑制，同时Treg型转录因子Foxp3、Ptpn2 mRNA表达明显降低（P<0.05）、Th17型转录因子Rorc mRNA表达增加（P<0.05）；⑤miR-155 过表达转染对 LPS-低氧刺激下 MSC间接处理体系中 CD4+T细胞增殖与凋亡的影响：与对照组相比，miR-155过表达转染对LPS-低氧刺激下MSC处理后的CD4+T细胞存活、增殖无明显影响（P>0.05）。
结论：TGF-β1是MSC通过旁分泌作用调控LPS-低氧诱导Treg/Th17分化失衡的因子或因子之一，通过抑制LPS-低氧诱导的CD4+T细胞miR-155表达、加强Treg细胞型相关转录因子Ptpn2与Foxp3 mRNA表达，抑制Th17型相关转录因子Rorc mRNA表达，促进Treg/Th17分化平衡。
目的：探讨高脂多糖合并低氧特征的严重感染患者外周血T细胞分化相关基因表达特点
方法：回顾性分析东南大学附属中大医院重症医学科临床数据库中符合社区获得性严重感染诊断的病例资料，根据入院时血浆脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）水平及氧合指数(Partial Pressure of Oxygen/ Fraction of inspiration O2 ， PaO2/FiO2, P/F ）进行分组：LPS>10pg/ml且P/F≤200mmHg为高LPS合并低氧组，LPS≤10pg/ml且P/F>200mmHg为对照组,记录基本资料、感染部位及可能的致病菌、入组时合并的器官功能障碍、器官支持技术及支持条件(如是否存在急性肾损伤、是否需要肾脏替代治疗及条件等），病情严重程度评分如：序贯器官衰竭评估评分、急性生理和慢性健康评估Ⅱ评分，入院后24小时内免疫炎症指标（白细胞计数、淋巴细胞计数、降钙素原、超敏C反应蛋白、白介素-6），采用Human LncRNA Microarray V4.0芯片检测全血mRNA表达，利用NCBI、GO、STRING数据库对T细胞相关基因进行差异性表达分析及生物学功能富集及。
结果：①一般情况：高LPS合并低氧组纳入9例，对照组纳入6例。高LPS合并低氧组患者血浆 LPS 水平显著高于对照组（ 66.25[16.05,97.48] vs. 5.00[5.00, 6.38] pg/ml, P=0.003），高LPS合并低氧组患者P/F显著低于对照组(129±62 vs. 346±55 mmHg, P＜0.001 ）；②疾病严重程度与器官功能损伤：高 LPS 合并低氧组患者肌酐水平 （164[79,332] vs. 60[55,105] umol/L, P=0.017）、乳酸水平（2.2[1.5,3.4] vs. 1.2[0.8, 2.0] mmol/L, P=0.039）显著高于对照组组，其SOFA评分更高（11±4 vs. 7±1, P=0.046），提示高 LPS 合并低氧特征患者病情严重程度更重; ③免疫炎症指标:与对照组组比较，高LPS 合并低氧组患者外周血淋巴细胞水平显著降低（ 0.4[0.3,0.6] vs. 0.8[0.5,1.2] /μL, P=0.020），中性粒细胞与淋巴细胞计数比值显著上升（17.9[7.1,23.4] vs. 6.8[2.9,12.3], P=0.050）,全身性炎症指标（体温、心率、呼吸频率、白细胞计数）、外周血降钙素原、超敏C反应蛋白、白介素-6水平无明显差异；④低氧信号通路：外周血芯片检测提示差异性基因在低氧信号通路存在富集，高 LPS 合并低氧组患者外周血细胞低氧反应相关基因表达显著上调（P<0.05）; ⑤T细胞分化相关基因表达分析：与对照组比较，高LPS合并低氧组Th17正向转录调控基因STAT3（P=0.006）及BATF（P=0.014），受体活化基因TLR2及细胞因子及其受体相关基因FABP5（P=0.016）及IL6ST（P=0.046）表达显著上调，Th17负向信号转导基因STAT5A（P=0.045）及PPARG（P=0.049）表达显著下调，提示分化为Th17表型的细胞增加；Treg功能相关基因TET3（P=0.004）表达显著下调，提示分化为Treg表型的细胞减少。
结论：高LPS合并低氧的严重感染患者疾病严重程度与器官功能损伤更重，外周血淋巴细胞降低更明显。其外周血细胞中Treg分化相关基因表达受抑，提示分化为Treg表型的细胞减少；Th17型分化相关基因表达增强，提示分化为Th17表型的细胞增加，导致Treg/Th17分化失衡。
第二部分 间充质干细胞处理对脂多糖-低氧诱导Treg/Th17分化失衡的影响
目的：建立 LPS-低氧诱导的 Treg/Th17 分化失衡体外细胞模型，探讨间充质干细胞（Mesenchymal stem cell, MSC）处理对Treg/Th17分化平衡的影响
方法：分离C57BL/6小鼠脾脏获得单细胞悬液，以磁珠纯化获得CD4+T细胞，予生理条件anti-CD3（5ug/ml）及anti-CD28（2ug/ml）活化刺激过夜，加入或不加入RAW264.7巨噬细胞（抗原提呈）进行单独或共培养。根据不同刺激条件分组：无刺激对照组，LPS （终浓度 0、10、100、1000ng/ml）刺激组，低氧（5%氧浓度）刺激组，LPS（不同浓度）-低氧共同刺激组。在LPS（100ng/ml）+低氧刺激条件下，通过transwell小室设置与MSC（鼠源性，Cyagen Biosciences, Inc.）直接共培养、间接共培养48小时，实施：①细胞样本Annexin V染色，流式细胞法检测T细胞存活率；②流式细胞法检测细胞样本中Treg、Th17亚群分化情况，以核染色CD25+Foxp3+鉴定Treg，以核内染色CD8-IL-17a+鉴定Th17细胞。
结果：①单纯 LPS 刺激对 CD4+T 细胞的影响：与无刺激对照组相比，LPS 刺激浓度10ng/ml组与100ng/ml组的CD4+T细胞存活比例、Treg分化比例均显著下降（均P<0.05）， Th17分化比例均显著升高（均P<0.05），LPS刺激浓度100ng/ml与1000ng/ml两组间CD4+T细胞存活比例、Treg分化比例、Th17分化比例均无差异；LPS刺激各组（10、100、1000ng/ml）中Treg/Th17比值均显著高于无刺激组（均P<0.001）；②单纯低氧刺激对 CD4+T细胞的影响：与无刺激组相比，低氧刺激组 CD4+T细胞存活无显著影响， Treg分化比例显著降低（P<0.05），Th17显著升高（P<0.05）；③LPS-低氧刺激对CD4+T细胞的影响：与无刺激组相比，在低氧基础上予各浓度 LPS 刺激，CD4+T 细胞存活、Treg分化比例均显著下降（均P<0.05），Th17分化比例均显著升高（均P<0.05），但低于各浓度LPS刺激组；与无刺激组相比，各浓度LPS合并低氧刺激时Treg/Th17比例均显著降低（均P<0.001）；LPS浓度为10ng/ml时，LPS-低氧刺激组Treg/Th17比值较单纯LPS刺激者（即LPS刺激浓度10ng/ml组）显著降低，其余浓度LPS刺激组与LPS-低氧刺激组的Treg/Th17 比值未见差异。④MSC 处理对 LPS-低氧刺激下 CD4+T细胞的影响：与LPS-低氧刺激组相比，MSC处理显著改善LPS-低氧刺激所致的Treg分化比例下降与Th17分化比例增加，使Treg/Th17比值升高（P<0.05），MSC直接处理或间接处理时Treg/Th17比值未见差异。
结论：LPS-低氧可诱导 Treg/Th17 分化失衡；MSC 处理可改善 LPS-低氧刺激所致的Treg/Th17分化失衡，该作用不依赖细胞直接接触机制。
第三部分 间充质干细胞调控脂多糖-低氧诱导Treg/Th17分化平衡的机制研究
目的：探讨MSC调控LPS-低氧刺激下Treg/Th17分化平衡的分子机制
方法：在 transwell 小室下层种植小鼠脾源性 CD4+T 细胞，上层加入 MSC（鼠源性， Cyagen Biosciences, Inc.）进行间接共培养，培养液中加入LPS（终浓度100ng/ml），置于5%O2低氧条件培养，以抗TGF-β1（10ug/ml）中和抗体明确MSC分泌的TGF-β1对Treg/Th17分化的影响；微小RNA（microRNA，miR）-155 mimic或mimic control转染CD4+T细胞4小时后移至tranwell小室，在LPS（100ng/ml）、5%O2低氧条件下与MSC间接共培养，48小时后实施：① 酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay， ELISA）检测培养液上清中促炎型细胞因子 IL-17A、INF-γ、IL-21 与抗炎型细胞因子TGF-β1、IL-10水平；②RT-PCR法检测miR-155、Tgfb1、Rorc、Foxp3及Ptpn2 mRNA表达状况；③流式细胞法检测细胞样本中 Treg、Th17 亚群分化情况，以核染色CD25+Foxp3+鉴定 Treg，以核内染色 CD8-IL-17a+鉴定 Th17 细胞；④细胞样本进行Annexin V/PI染色，流式细胞法检测CD4+T细胞存活率；⑤细胞样本进行CTV染色， 72小时后流式细胞法检测miR-155mimic/inhibitor转染后对CD4+T细胞增殖能力。
结果：①MSC 处理对 LPS-低氧刺激下培养液上清中细胞因子分泌的影响：与无 MSC处理相比，MSC处理培养液中TGF-β1、IL-17、IL-10分泌水平均显著升高（均P<0.05）；②抗TGF-β1阻断LPS-低氧刺激下MSC间接共培养对Treg/Th17分化平衡的影响：与MSC处理相比，抗TGF-β1抗体可明显抑制LPS-低氧刺激环境下MSC对Treg/Th17失衡的调控作用（P<0.05），即MSC增加Treg、降低Th17的作用消失；③MSC分泌TGF-β1对LPS-低氧刺激下CD4+T细胞miR-155表达的影响：LPS-低氧刺激可显著提高CD4+T细胞miR-155表达（P<0.05），与MSC未处理相比，MSC间接共培养处理可抑制CD4+T细胞miR-155表达，而抗TGF-β1可明显阻断MSC间接共培养对CD4+T细胞miR-155表达的抑制作用（P<0.05）；④miR-155转染对LPS-低氧刺激下MSC间接处理CD4+T细胞调控Treg/Th17分化平衡的影响：CD4+T过表达miR-155时，MSC间接处理对LPS-低氧诱导的Treg/Th17失衡的调控作用受到抑制，同时Treg型转录因子Foxp3、Ptpn2 mRNA表达明显降低（P<0.05）、Th17型转录因子Rorc mRNA表达增加（P<0.05）；⑤miR-155 过表达转染对 LPS-低氧刺激下 MSC间接处理体系中 CD4+T细胞增殖与凋亡的影响：与对照组相比，miR-155过表达转染对LPS-低氧刺激下MSC处理后的CD4+T细胞存活、增殖无明显影响（P>0.05）。
结论：TGF-β1是MSC通过旁分泌作用调控LPS-低氧诱导Treg/Th17分化失衡的因子或因子之一，通过抑制LPS-低氧诱导的CD4+T细胞miR-155表达、加强Treg细胞型相关转录因子Ptpn2与Foxp3 mRNA表达，抑制Th17型相关转录因子Rorc mRNA表达，促进Treg/Th17分化平衡。