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转座子(transposon)是宿主基因组DNA中一类具有移动性的特殊序列，作为遗传重组因子广泛存在于生物基因组中。piggyBac(PB)转座子是一种依赖于PB转座酶的DNA转座子，大量研究表明PB转座子能识别哺乳动物细胞基因组中TTAA四碱基位点进行高效转座，作为一种安全高效的工具载体广泛应于转基因研究。人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)存在于大部分干细胞和癌细胞中，以其自带的RNA为模板延长细胞染色体端粒长度。hTERT的表达和激活被认为是细胞永生化发生的重要事件。为了构建一种通用的细胞永生化载体，本研究将传统的PB转座子二元质粒系统整合为单质粒系统，引入优化的双报告基因筛选元件和hTERT表达框，提高了细胞永生化载体的转座效率、可操作性和安全性，在细胞永生化载体构建上进行了初步探索，也为其他真核载体的构建和改造提供了参考。同时，本研究选用牛乳腺上皮细胞(Bovine mammary epithelial cells, BMECs)进行永生化载体的初步细胞验证，以期得到具有hTERT活性的牛乳腺上皮细胞，进而为牛乳腺上皮永生化细胞系的建立奠定基础。主要研究内容如下：1.设计合成一个一元piggyBac(PB)转座子为载体骨架，包含转座必须元件的5’TR和3’TR DNA序列、绝缘子核心序列CHS4、一个由TK启动子介导的PB转座酶(PBase)表达框和一个含有10个稀有酶切位点的多克隆位点(MCS)；引入由P2A连接绿色荧光蛋白(EGFP)和嘌呤霉素基因(Puro)的筛选元件和人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因表达框，在筛选元件两端引入两个方向相同的loxP序列，并对构建好的载体pTP-hTERT进行酶切和测序鉴定以及Cre–loxP剪切功能验证，结果表明，通用型永生化载体pTP-hTERT构建成功。2.使用pTP-hTERT转染HEK293细胞，进行阳性克隆筛选，通过RT-PCR、Westernblotting和热不对称PCR(Tail-PCR)检测hTERT基因表达、筛选元件P2A功能和转座整合位点侧翼序列；通过细胞克隆亚甲蓝染色和非配对t检验(student’s T-test)分析，比对染随机整合载体和pTP-hTERT整合效率。结果表明，转染后能筛选出表达EGFP的抗嘌呤霉素单克隆细胞，目的基因hTERT能正常转录，筛选片段P2A高效切割EGFP和Puro融合蛋白，载体以转座形式整合入宿主基因组，且PB转座整合效率显著高于随机整合效率(P<0.01)。3. pTP-hTERT转染牛乳腺上皮细胞，筛选阳性单克隆并进行hTERT表达检测，结果显示能够获得表达绿色荧光蛋白EGFP的抗嘌呤霉素单克隆细胞，获得的hTERTBMECs能够表达hTERT蛋白，并且该蛋白具有正常的端粒酶活性，初步验证结果证明pTP-hTERT能够应用于乳腺上皮永生化细胞系的建立。