内皮祖细胞移植改善大鼠肝移植缺血再灌注损伤的研究

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目的:成功提取SD大鼠骨髓单个核细胞,体外培养并诱导其分化为血管内皮祖细胞(EPCs);成功鉴定及染色EPCs,用以干细胞移植实验;成功建立大鼠原位肝移植(OLT)模型,观察对发生肝移植缺血再灌注损伤(IRI)的大鼠移植EPCs后,内皮祖细胞是否在大鼠肝血窦内发生归巢并观察EPCs移植对肝移植后IRI相关指标的影响。方法:从同种SD大鼠股骨及胫骨骨髓中采用Percoll密度梯度离心法提取单个核细胞,二次贴壁后以选择性DMEM培养液诱导其分化,观察其形态学改变,对其进行免疫细胞化学染色鉴定和双荧光染色鉴定,并以红色荧光染料PKH26GL标记;将48只SD大鼠随机分为2组,采用改良Kamada袖套法建立大鼠原位肝移植模型,分组为OLT+EPC移植组12对和OLT对照组12对,EPC组肝移植受体大鼠关腹后经尾静脉输注EPCs,对照组经尾静脉输注生理盐水;两组均于术后6小时,24小时,48小时取血液标本及肝组织标本,冰冻切片荧光观察EPCs归巢情况,免疫组化观察肝血管区的EPCs抗原表达;检测肝功能ALT及血清TNF-α水平,HE观察肝组织病理损伤并评分。结果:成功提取大鼠单个核细胞并诱导培养为EPCs,形态学观察,免疫细胞化学染色和双荧光染色鉴定其为EPCs;在3个时间点中EPC组可用荧光显微镜观察到EPCs在肝血窦中的归巢,免疫组化可观察肝血管区有EPCs抗原阳性表达;在3个时间点中,EPC组较对照组肝脏损伤较轻,肝功能改善明显,血清中炎症因子表达较低,具有统计学意义(p<0.05)。结论:密度梯度离心法提取骨髓单个核细胞后,取二次贴壁细胞分化培养可以获得用以移植的足够数量和纯度的EPCs;EPC移植后可在损伤肝脏中归巢,从而增加血管新生,修复损伤肝血窦,改善微循环,抑制细胞凋亡,缓解组织炎症,最终改善肝移植术后的缺血再灌注损伤。
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