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目的:应用自行制备的量子点标记链霉亲和素、AKR1B10重组蛋白、生物素标记兔抗AKR1B10多克隆抗体、以及本实验室制备保存的羊抗AKR1B10多克隆抗体,建立一种分析灵敏度高、特异性好的基于量子点标记的双抗夹心荧光免疫检测法,对AKR1B10蛋白进行检测。方法:1.以多肽CCGKEK为模板,快速合成水溶性金量子点,通过EDC/NHSS偶联的方法将金量子点QDs与链霉亲和素SA进行连接,获得金量子点标记链霉亲和素QDs-SA。2.构建PET-15b/AKR1B10重组质粒,将其转化至大肠杆菌DH5α中表达,使用Ni-NTA树脂对克隆表达的带多聚组氨酸标签(His-Tag)的融合蛋白His-Tag-AKR1B10进行纯化。3.将AKR1B10重组蛋白免疫家兔获得多克隆抗体,ELISA法测定抗体效价后,对抗体进行纯化。使用N-羟基琥珀酰亚胺生物素(BNHS)对兔抗AKR1B10多克隆抗体进行标记,获得biotin-AKR1B10 兔抗。4.采用双抗夹心法,联合应用生物素-亲和素放大系统与金量子点标记技术,建立荧光免疫分析试剂盒:以本实验室制备保存的羊抗AKR1B10多克隆抗体作为固相抗体,biotin-AKR1B10兔抗作为检测抗体,加入量子点标记链霉亲和素,最后通过测定相对荧光强度对AKR1B10蛋白含量进行检测。结果:1.同SA偶联的金量子点QDs-SA与未偶联的金量子点QDs相比,荧光光谱曲线并无显著差异,QDs-SA的波峰稍低,但俩者峰型相同,最大激发波长均为332nm。QDs-SA荧光发射峰位置出现轻度蓝移处于401nm,它仍具有良好的分散性及光谱性能。QDs-SA具备良好的生物活性,每毫克金量子点可连接约184μg的链霉亲和素。2.菌液PCR与测序鉴定表明重组质粒PET-15b/AKR1B10构建成功,重组质粒在表达菌E.coli DH5α中能有效表达一个分子量约为36kDa的分泌蛋白,Ni-NTA层析柱对蛋白起到了高效纯化作用,纯化后的蛋白可免疫家兔产生抗血清。3.兔抗AKR1B10多克隆抗体的效价达1:80000,纯化后的抗体特异性较好,与AKR1B1的反应极弱,生物素与兔抗AKR1B10多克隆抗体连接成功。4.羊抗AKR1B10多克隆抗体的最佳包被浓度为6μg/mL,检测抗体生物素标记兔抗的最佳浓度为0.2μg/mL,量子点标记的链和亲霉素的最佳稀释倍数是1:100。结论:成功建立了一种基于量子点标记的双抗夹心荧光免疫AKR1B10检测方法。