论文部分内容阅读
目的研究连续血液滤过对脓毒症的治疗作用及GEF-H1/Rho A信号通路在血液滤过中对脓毒症内皮细胞的影响方法1、根据临床脓毒症患者的诊断标准(2.1.1),收集脓毒症患者血清,并进行连续血液滤过处理。应用浓度为10%的滤过前后血清分别干预肺血管内皮细胞(PVECs)0h、2h、4h、6h、8h,然后采用细胞单层细胞阻抗性实验和通透性实验比较分析滤过前后血清对细胞阻抗性和通透性的影响;2、应用浓度为10%的滤过前后血清干预PVECs24h,采用Real-time PCR和Western Blot方法分别检测ICAM-1和VCAM-1的m RNA及蛋白质表达水平变化,并进行统计分析;3、应用Real-time PCR和Western Blot方法分别检测滤过前后血清中GEF-H1m RNA和蛋白表达水平的改变,并进行统计分析;4、构建GEF-H1干扰载体,使用脂质体3000(Lipofectamine 3000)进行细胞转染24h,应用Real-time PCR和Western Blot分别检测GEF-H1 m RNA和蛋白表达水平,选取干扰效率最高的载体进行稳转细胞株筛选。应用浓度为1.0μg/m L嘌呤霉素筛选5周,构建GEH-H1低表达稳转细胞株(sh RNA-GEF-H1)。同时,实验设置阴性对照组(sh RNA),并进行细胞阻抗性及通透性检测以及统计分析;5、构建GEF-H1过表达载体并进行细胞转染,然后应用浓度为200μg/m L的G418筛选6周,构建GEH-H1过表达稳转细胞株(pc DNA-GEF-H1)。同时,实验设置阴性对照组(pc DNA),并检测两组细胞阻抗性及通透性,进行统计分析。结果(1)细胞阻抗性实验分别检测0h、2h、4h、6h、8h两组细胞的跨细胞电阻,与连续血液滤过前血清干预组相比,连续血液滤过后血清干预组肺血管内皮细胞的阻抗性不断升高,且呈现时间依赖性,二者在6h和8h具有显著性差异(F=3.498,P<0.01;F=2.671,P<0.001);同时,细胞通透性实验分别检测0h、2h、4h、6h、8h两组细胞的细胞通透率,与滤过前血清干预组相比,滤过后血清干预组肺血管内皮细胞的通透率不断降低,且呈现时间依赖性,二者在6h和8h具有显著性差异(F=10.150,P<0.01;F=7.465,P<0.001)(2)与连续血液滤过前血清相比,连续血液滤过后的血清中ICAM-1及VCAM-1的m RNA表达显著降低(F=1.755,P<0.05;F=1.538,P<0.01),同时,蛋白表达水平也明显降低(F=1.156,P<0.001;F=3.288,P<0.001);差异均具有统计学意义。(3)与连续血液滤过前相比,滤过后的血清能够显著抑制PVECs中GEF-H1m RNA和蛋白的表达(F=8.533,P<0.001;F=16.260,P<0.05),差异具有统计学意义。(4)与对照组相比,GEF-H1干扰组GEF-H1无论是m RNA还是蛋白表达均显著降低(F=4.213,P<0.01;F=1.541,P<0.01);同时,Rho A蛋白质表达水平随之降低(F=1.025,P<0.01);PVECs的抗性升高(F=34.820,P<0.01),通透性降低(F=3.484,P<0.01),差异均具有统计学意义。(5)与对照组相比,GEF-H1过表达后GEF-H1在m RNA和蛋白表达水平均显著增强(F=12.850,P<0.01;F=6.183,P<0.01),Rho A蛋白质表达水平也明显升高(F=2.650,P<0.01);同时,肺血管内皮细胞的抗性降低(F=2.591,P<0.01),通透性升高(F=5.707,P<0.01),差异均具有统计学意义。结论(1)连续血液滤过后的脓毒症血清较血液滤过前的脓毒症血清能够增加内皮细胞抗性,降低内皮细胞的通透性。(2)ICAM-1及VCAM-1可能参与了连续血液滤过对脓毒症的内皮细胞通透性的影响(3)GEF-H1/Rho A信号通路参与连续血液滤过脓毒症血清对内皮细胞的调节作用