一、背景和目的　　肝癌（liver cancer）是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，每年约有383000人死于肝癌，占世界肝癌总死亡人数的51%[1]，其中以原发性肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）最为常见。HCC 的发生与肝炎病毒感染密切相关，尤其以乙肝病毒（HBV）和丙肝病毒（HCV）为主[2-4]，且我国 HBV的感染者众多，因此 HCC的发病率和死亡率相对较高。自1992年以来，虽然通过接种疫苗等方法有效阻止了HBV的传染，但最近几年HBV感染导致的HCC的发病率仍有上升的趋势[1]。手术是目前治疗HCC的主要手段，虽然以奥沙利铂（L-OHP）为主的FOLFOX4化疗方案已应用于临床，但效果依然十分有限。在针对 371 名不能接受手术的晚期HCC患者进行化疗的Ⅲ期临床试验中发现，与单独使用多柔比星的患者相比，FOLFOX4 治疗组的mPFS得到了一定程度的延长(1.77 mo vs 2.93 mo,p＜0.001)，虽然差异具有统计学意义，但从临床实际情况来看，一个多月的提升效果并不十分理想[5]。PD-L1（programmed death-ligand 1，PD-L1）是一种常见的免疫检查点分子，在DC细胞、肿瘤及其间质细胞等有广泛的表达，PD-L1能通过配对结合PD-1抑制T淋巴细胞的活性和功能，诱导肿瘤免疫逃逸的发生[6-8]。有研究报道，在某些实体肿瘤的治疗中，一些常见的化疗药能使PD-L1表达升高，从而导致疗效下降甚至失败[9, 10]。在L-OHP治疗HCC过程中是否也会导致这一现象发生，还未见文献报道。本课题拟通过实验研究，了解PD-L1在L-OHP治疗HCC过程中的表达情况和作用机制，探讨阻断 PD-L1 在增强 L-OHP治疗HCC效果中发挥的作用，为解决HCC的化学治疗效果不佳这一难题提供新的理论依据。　　二、方法　　第一部分 PD-L1在HCC中的基础表达情况及L-OHP作用后的表达变化情况　　1.使用免疫组化和Western Blot等实验方法，检测人HCC组织和人HCC细胞系HepG2中PD-L1的基础表达量。　　2. 使用CCK-8细胞活性实验检测L-OHP对HepG2细胞的杀伤作用，计算IC50，并以此为参考确定实验的加药浓度。　　3.使用qRT-PCR和Western Blot等实验方法，分别在mRNA和蛋白水平检测L-OHP作用HepG2细胞后PD-L1的表达变化情况。　　第二部分 L-OHP联合抗PD-L1单抗治疗HCC的实验研究　　1. 抽取人新鲜血液，使用淋巴细胞分离液提取出血液中的外周血单个核细胞（PBMC）。激活PBMC中的T淋巴细胞后，建立HepG2细胞和PBMC的共培养模型，分为1个空白对照组和3个治疗组（NC组，L-OHP组，anti-PD-L1组，L-OHP+anti-PD-L1组），使用平板克隆实验和划痕实验检测各组药物对HepG2细胞功能的影响。　　2. 取24只C57BL/6J小鼠，皮下注射同源小鼠肝癌细胞Hepa1-6，建立肝癌移植瘤模型。将模型小鼠分为1个空白对照组和3个治疗组（NC组，L-OHP组，anti-PD-L1组，L-OHP+anti-PD-L1 组），治疗结束后计算各组小鼠肿瘤的质量、肿瘤抑制率和生存时间。　　第三部分 L-OHP导致PD-L1上调的机制研究　　1.L-OHP作用HepG2细胞24h后，使用qRT-PCR和Western Blot实验检测CDK5和p-ERK1/2的表达变化情况。　　2.UO126抑制ERK1/2的磷酸化后，再加入L-OHP作用HepG2细胞24h，然后使用Western Blot实验检测PD-L1的表达变化情况。　　3.PMA促进ERK1/2的磷酸化后，使用Western Blot实验检测PD-L1的表达变化情况。　　三、结果　　第一部分 PD-L1在HCC中有基础表达，而L-OHP能够上调HepG2细胞PD-L1的表达　　1.免疫组化和Western Blot实验结果显示：PD-L1在临床HCC组织和人HCC细胞株HepG2中均有表达。　　2.CCK-8实验结果显示：L-OHP能明显抑制HepG2细胞的生长，且呈剂量依赖性。　　3.qRT-PCR和Western Blot实验结果显示：无论在mRNA还是蛋白水平，L-OHP均能诱导HepG2细胞的PD-L1表达上调（p＜0.05）。　　第二部分 抗PD-L1单抗能显著增强L-OHP的抗HCC作用　　1. 划痕实验和平板克隆实验结果显示：L-OHP 组、anti-PD-L1 组和L-OHP+anti-PD-L1组的HepG2细胞克隆形成能力和迁移能力均小于NC组（p＜0.05），其中L-OHP组和anti-PD-L1组之间的HepG2细胞克隆形成能力和迁移能力差异无统计学意义（p＞0.05），L-OHP+anti-PD-L1组的HepG2细胞克隆形成能力和迁移能力小于L-OHP组和anti-PD-L1组（p＜0.05）　　2.小鼠 HCC 移植瘤模型结果显示：L-OHP 组和 anti-PD-L1 组的肿瘤质量小于NC组（p＜0.05），肿瘤抑制率大于NC组（p＜0.05），L-OHP组和anti-PD-L1组之间的肿瘤质量和肿瘤抑制率均无明显差异（p＞0.05），L-OHP+anti-PD-L1组的肿瘤质量小于其余3组（p＜0.05），肿瘤抑制率大于其余3组（p＜0.05）。　　第三部分 L-OHP可通过提高ERK1/2磷酸化水平上调HCC细胞的PD-L1表达　　1.L-OHP作用HepG2细胞后，qRT-PCR和Western Blot实验结果显示，CDK5表达量在mRNA和蛋白水平均无明显改变（p＞0.05），p-ERK1/2表达量则明显增加。　　2. 使用ERK1/2的抑制剂UO126抑制其磷酸化后，再加入L-OHP作用HepG2细胞24h，Western Blot实验结果显示，PD-L1表达量无明显改变。　　3.使用ERK1/2的激动剂PMA促进其磷酸化后，Western Blot实验结果显示， PD-L1表达量明显增加。　　四、结论　　L-OHP 在治疗 HCC 的同时，能够通过促进 ERK1/2 的磷酸化水平上调 HCC 的PD-L1表达，从而导致治疗失败。而此时联合使用抗PD-L1单抗阻断PD-L1，L-OHP的抗HCC作用将得以显著提升。