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禽白血病（Avian leukosis,AL）是由禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）引起的一类可垂直传播和水平传播的肿瘤性疾病,以多器官组织出现肿瘤、免疫抑制、生长性能下降和死淘率增加等为主要特征,对养禽生产危害巨大。A、B、J和K等不同亚群ALV在我国鸡群中均有报道,其中A/B亚群禽白血病在我国地方品系种鸡群中时有发生,造成了很大的经济损失,而A/B亚群不易区分,希望能建立一种特异性针对B亚群ALV的检测方法,以区分ALV-A与ALV-B。值得注意的是,K亚群ALV（ALV-K）是近几年在我国地方品系鸡群中新发现的一个ALV亚群,可能一直存在于我国地方品系鸡群。目前有关ALV-K的诊断方法主要依靠病毒分离和囊膜基因测序比较,缺少其他的鉴别诊断方法。虽然美国有一些特定的鸡品系,其产生的原代细胞可以分别限制特定亚群外源性ALV生长,但是这些品系鸡的稀有性,和原代细胞的不可永久传代以及携带不方便等原因限制了其效能的发挥。20世纪90年代,美国ADOL实验室基于DF-1细胞系,率先建立了可特异性限制J亚群禽白血病病毒（ALV-J）感染的DF-1/J细胞系,并将其应用于临床样品的鉴别诊断。课题组前期已经建立起可特异性限制ALV-A感染的DF-1/A细胞系。因此构建可以鉴别诊断不同ALV亚群（ALV-B、ALV-K）的永生细胞系,并以这些细胞系为基础的ALV亚群鉴定诊断方法可以丰富区分ALV亚群的诊断工具箱。为了构建特异性抗B亚群ALV感染的永生细胞系,本研究先从ALV-B的超感染抗性出发,将其env基因插入真核表达载体pcDNA3.1/Zeo（+）,构建重组质粒pcDNA-env-B,然后将pcDNA-env-B转染鸡胚成纤维细胞系DF-1。转染后的细胞经Zeocin连续筛选21d后,形成单细胞克隆株,并将该克隆株细胞通过Zeocin连续克隆化筛选60代次。为了检验细胞系中env基因的遗传稳定性,通过普通PCR、荧光定量PCR方法检验筛选出细胞系的env核酸,结果表明筛选出的细胞系中的env基因遗传稳定;通过间接免疫荧光和Western blot方法检测DF-1/B中env蛋白表达,结果发现筛选出的细胞系能够表达ALV-B env蛋白;免疫电镜发现ALV-B的env蛋白在抗性细胞系的细胞囊膜区域表达。通过Zeocin筛选获得了1株可稳定表达ALV-B env基因的鸡胚成纤维永生细胞系,命名为DF-1/B。通过对DF-1/B细胞系进行了体外抗ALV感染试验,结果显示:DF-1/B细胞系有很强的抗ALV-B感染能力,能抗1×104个TCID50ALV-B感染,而对ALV-J无显著抑制作用。为了构建特异性抗K亚群ALV感染的永生细胞系,本研究又从ALV-K的超感染抗性出发,将其env基因插入真核表达载体pcDNA3.1/Zeo（+）,构建重组质粒pcDNA-env-K,然后将pcDNA-env-K转染鸡胚成纤维细胞系DF-1。转染后的细胞经Zeocin连续筛选21 d后,形成单细胞克隆株,并将该克隆株细胞通过Zeocin连续克隆化筛选60代次。为了检验细胞系中env基因的遗传稳定性,通过普通PCR、荧光定量PCR方法检验筛选出细胞系中的env核酸,结果显示筛选出的细胞系中的env基因遗传稳定;通过间接免疫荧光和Western blot方法检测细胞系中env蛋白表达,结果发现筛选出的细胞系能够稳定表达ALV-K env蛋白;免疫电镜发现ALV-K的env蛋白也在抗性细胞系的细胞囊膜区域表达。通过Zeocin筛选获得了1株可稳定表达ALV-K env基因的鸡胚成纤维永生细胞系,命名为DF-1/K。通过对DF-1/K细胞系进行了体外抗ALV感染试验,结果显示:DF-1/K细胞系有很强的抗ALV-K感染能力,能抵抗1×104个TCID50 ALV-K的感染,而对ALV-A、ALV-B和ALV-J等其他亚群均无显著抑制作用。为了进一步验证DF-1/K细胞系的功能,本论文又将临床分离到的四株ALV-K（GDFX0602,GDFX0603,GD147,GD179）毒株分别接种DF-1和DF-1/K细胞,结果发现DF-1/K细胞系能有效抵抗各个ALV-K毒株的感染,进一步证明了DF-1/K细胞系具有良好的特异性抗ALV-K感染能力。为了评估DF-1/B和DF-1/K细胞系在临床鉴别诊断的应用效果,本论文将收集的108份临床血浆样品分别同时接种DF-1、DF-1/A、DF-1/B和DF-1/K,结果发现有1份样品在DF-1/B细胞系ALV p27 S/P值显著低于DF-1、DF-1/A和DF-1/K,提示该样品可能含有ALV-B,经env基因测序证实该样品含有ALV-B;同时发现有2份样品在DF-1/K细胞系的ALV p27 S/P值显著低于DF-1、DF-1/A和DF-1/B,提示该样品可能含有ALV-K,经env基因测序证实该2份样品都含有ALV-K;表明所构建的DF-1/B、DF-1/K具有鉴别诊断临床样品不同亚群ALV的能力。DF-1/B和DF-1/K永生细胞系的构建与应用,丰富了不同亚群ALV的鉴别工具箱,可进一步促进我国禽白血病流行学调查和净化、尤其是黄羽肉鸡禽白血病净化;同时这些细胞系为进一步研究病毒与宿主细胞互作的分子机理奠定了基础。