研究背景及目的虽然颅咽管瘤在病理上是良性肿瘤，但其治疗对于神经外科医生来说一直就是极富挑战性的课题。随着对其认识的不断深入，以及现代影像学技术和显微神经外科技术的迅速发展，许多现代神经外科单位都将争取肿瘤全切除作为首要的治疗选择。仍有两点非常棘手，一是术后复发，另一就是术后并发症及患者生活质量。就术后复发而言，从临床的角度来看，目前认为肿瘤切除程度和肿瘤的病理类型是影响术后复发的两大关键因素。病理上，现一般将颅咽管瘤分为鳞状乳头型和造釉细胞型两肿病理类型。近年来众多国内外学者认为两者不仅病理结构不同，临床表现和预后也不同。造釉细胞型多见于儿童患者，预后较鳞状乳头型差，术后复发率较高。因为肿瘤细胞是按活动周期进行增殖的，肿瘤细胞的增殖能力及增殖速度是决定肿瘤生物学行为关键的内在因素，是否以上两种病理类型的不同预后及复发性也与其内在增殖性有关，近年来已有部分国内外学者进行了相关研究，所选用的增殖指标主要有PCNA、Ki-67及其同类物质MIB-1、BrDU以及Agnor等，但其结论不完全一致。p21及异质性细胞核核糖蛋白A2／B1（hnRNP A2／B1）是近年来发现的在细胞增殖周期中有重要作用的两个基因，有报道它们与许多肿瘤的发生、发展有关，但对于颅咽管瘤，其意义如何，国内外尚未见报道。此外，尽管颅咽管瘤的提出已经有一百多年的历史，其起源一直存在争论，比较公认的胚胎残余学说和鳞状上皮化生学说均各有其矛盾之处。为了更好的解决颅咽管瘤的发生问题，人们开始逐步倾向于分子与基因结构的研究。有研究认为其发生可能与染色体上某基因改变而激活了致癌基因有关，另有研究发现部分造釉细胞型颅咽管瘤中存在β—连接素外显子3基因突变，但国内均未见此类报道。因此，进一步研究颅咽管瘤细胞增殖性及其发生，对于了解术后复发的根本原因具有重要意义，可为进一步阐明颅咽管瘤的生物学行为提供理论依据。本研究主要目的：1对不同病理类型颅咽管瘤p21和hnRNPA2／B1蛋白，以及hnRNPA2／B1 mRNA进行分子病理学和分子生物学研究。2研究不同病理类型颅咽管瘤细胞增殖性的差异及意义。3研究颅咽管瘤β—连接素表达及其外显子3基因突变情况及意义。材料和方法1颅咽管瘤p21和hnRNPA2／B1蛋白表达的研究1．1临床资料标本取自我院2002年1月至2005年12月手术切除的81例颅咽管瘤患者，其中男49例，女32例；年龄2～73（21.1±16.22）岁。所有病例经术后病理确诊为颅咽管瘤，其中造釉细胞型62例（76.5％），鳞状乳头型19例（23.5％）。将所有标本组织块放入液氮冷冻保存备用。1．2实验方法采用免疫组化SP法分别检测p21和hnRNP A2／B1蛋白在81例颅咽管瘤组织中的表达，分别计算p21标记指数（p21 LI）和hnRNP A2／B1标记指数（hnRNPA2／B1 LI），以反应不同病理类型颅咽管瘤的增殖活性。肿瘤标本经10％福尔马林固定，常规石蜡包埋后连续切片，以4μm厚切片行CD45免疫组织化学染色。免疫组织化学染色方法采用SP二步法，微波修复抗原，DAB显色，显微镜下观察。分别将已知的阳性片设为阳性对照。所有的标本均以PBS代替一抗作为阴性对照。细胞质或细胞核呈棕黄色至深棕黄色为阳性染色细胞，每张切片选取细胞分布均匀的5个高倍（400×）视野作为观察区，计算阳性细胞数及视野内细胞总数，求5个视野内细胞数的平均值。细胞质或细胞核的标记指数根据以下公式计算：LI=阳性细胞数／计数细胞总数×100％。1．3统计学分析采用SPSS10.0统计软件进行统计学分析，数据用（（?）±s）表示。对p21 LI和hnRNP A2／B1 LI在两种不同病理类型颅咽管瘤中的差异性，分别进行两独立样本t检验；对两种不同病理类型颅咽管瘤中，以及全部颅咽管瘤组织中，p21 LI和hnRNP A2／B1 LI之间的相关性，分别进行Pearson相关分析。以P＜0.05为差别有显著性。2颅咽管瘤hnRNP A2／B1 mRNA的研究2．1临床资料同1．12．2实验方法按操作说明用Promega RNA抽提剂提取各肿瘤组织标本总RNA，取4μlRNA溶液，按照Promaega逆转录试剂盒说明依次加入各成分，按下述条件进行逆转录反应：42℃60分钟，95℃5分钟，4℃5分钟。设计hnRNP A2／B1引物序列（应用生物学软件DNASTAR设计）：上游引物：5’-CTG TIT GTF GGC GGA ATI’-3’，下游引物5’-ACC CAT TAT AGC CAT CCC-3’，扩增片段长度为226个碱基。探针序列：5’-FAM-ATC ATC CAC TGT GGT AGC AGC CGC-TAMRA-3’。用PE7300荧光定量PCR反应体系试剂盒进行PCR：反应管中依次加入TaqMan探针1μl，上下游引物（10pmol／μl）各0.5μl，逆转录产物2μl，Taq酶0.25μl，10mMdNTP1μl，10×PCR Buffer 2μl，加H₂O 12.25μl使总反应体积为20μl。PCR反应条件为：93℃4分钟，（93℃30秒，62℃30秒）×40次。GAPDH作为内参照。荧光定量操作系统所得数据结果Ct值使用PE7300系统自带的SDS软件自动同步处理。2．3统计学分析采用SPSS10.0统计软件进行统计学分析，数据用（（?）±s）表示。对不同病理类型颅咽管瘤hnRNPA2／BlmRNA表达的差异性行两独立样本t检验分析，以P＜0.05为差别有显著性。3颅咽管瘤β—连接素表达及基因突变的研究3．1临床资料标本选自我院2004年1月至2006年1月手术切除的23例均颅咽管瘤患者，其中男15例，女8例；年龄3～58（21.6±15.94）岁。所有病例经术后病理确诊为颅咽管瘤，其中造釉细胞型20例，鳞状乳头型3例。所有标本组织块放入液氮冷冻保存备用。3．2β—连接素蛋白在不同病理类型颅咽管组织中的表达每例肿瘤标本取部分经10％福尔马林固定，常规石蜡包埋后连续切片，以4μm厚切片行β—连接素免疫组织化学染色。具体实验方法同1．2。细胞中出现棕黄色为阳性染色。3．3不同病理类型颅咽管瘤β—连接素基因突变分析使用TIAGEN公司生产的TIANamp Genomic_血液／细胞／组织基因组DNA提取试剂盒（含蛋白酶K）进提取样品DNA。样品先在液氮中研碎，其他操作按说明书进行。提取的DNA样品直接用于PCR实验。用以下引物对：5’-gatttgatggagttggacatgg-3’和5’-tgttcttgagtgaaggactgag-3’扩增β-连接素外显子3序列。PCR反应体系如下：5×PCR Buffer 4μl，10nmol／L dNTP 1μl，DNA提取物2μl，P1 1μl，P2 1μl，5U／μl ExTaq 0.25μl，水40.75μl，反应总体积50μl。PCR反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，循环26次，扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段为228bp。把PCR产物送往Invitrogen公司（上海）测序。测序结果使用DNAstar程序做多序列比对。结果1 p21和hnRNPA2／B1免疫组化结果hnRNP A2／B1在颅咽管瘤细胞中的表达呈弥散性，主要在细胞核中表达，部分在胞浆中表达。造釉细胞型颅咽管瘤hnRNPA2／B1 LI（51.72％±8.31％）显著高于鳞状乳头型颅咽管瘤hnRNP A2／B1 LI（45.35％±7.51％）（t=2.988，P=0.004，95％可信区间：2.128～10.623）。p21在颅咽管瘤组织的各层细胞中的表达也呈弥散性，全部在细胞核内。经定量分析发现p21蛋白表达在鳞状乳头型颅咽管瘤中（34.05％±6.77％）显著高于在造釉细胞型颅咽管瘤中（28.24％±4.60％）（t=-3.501，P=0.002，95％可信区间：-9.243～-2.381）。相关性分析，p21和hnRNP A2／B1在全部颅咽管瘤组织中的表达没有相关性（r=-0.197，P=0.078）。从不同病理类型来看，在鳞状乳头型中，二者的表达强度也没有相关性（r=0.442，P=0.058），但在造釉细胞型中，二者的表达阳性率呈负相关关系（r=-0.271，P=0.033）。2 hnRNPA2／B1 mRNA表达结果HnRNP A2／B1测定的阳性标准品和检测样品的实时荧光扩增动力曲线平滑，每条曲线均有明显的指数扩增期；根据循环阈值（Ct），经对数拟合做图，得到定量标准曲线，所得标准曲线回归系数为0.997，起始模板浓度与Ct值之间呈良好的线性关系，说明定量结果准确、可靠。定量计算，造釉细胞型颅咽管瘤hnRNP A2／B1mRNA表达量为（58.38±22.67）×10³copies／μg，鳞状乳头型颅咽管瘤hnRNPA2／B1mRNA表达量为（13.24±1.53）x10³copies／μg。经两独立样本t检验，造釉细胞型颅咽管瘤hnRNPA2／B1mRNA表达量显著性高于鳞状乳头型颅咽管瘤（t=6.738 P=0.010）。3β—连接素表达及基因突变结果3．β—连接素免疫组化结果在两种病理类型中，β—连接素的染色明显不同。所有造釉细胞型颅咽管瘤均存在细胞膜和细胞浆染色，在外周的栅栏状细胞中，表达更为明显；在栅栏状细胞簇和呈指状突起的上皮细胞簇中，还可见明显的细胞核染色。鳞状乳头型颅咽管瘤均仅见细胞膜染色。3．2β—连接素基因突变结果送检的23例样本中，有5例未检测出结果，估计是样本不纯，该5个样本放弃。在进行测序成功的18个样本中，其中3例鳞状乳头型颅咽管瘤均未检测到β-连接素外显子3基因突变。其余15例造釉细胞型颅咽管瘤样本中，有6例（40％）检测到β-连接素外显子3基因突变，这些突变均影响其糖原合成酶3β（GSK-3β）的丝氨酸／苏氨酸磷酸化位点。其中3例位于第33位密码子，由TCT突变为TTT，相应氨基酸由丝氨酸突变为苯丙氨酸；1例发生于第37位密码子，由TCT突变为TGT，相应氨基酸由丝氨酸突变为半胱氨酸；另2例发生于第41位密码子，由ACC突变为ATC，相应氨基酸由苏氨酸突变为异亮氨酸。结论1本实验从细胞及分子水平发现两种病理类型颅咽管瘤细胞增殖活性存在显著性差异。这说明在手术未能全切除的情况下，增殖活性较高的造釉细胞型较增殖活性相对较低的鳞状乳头型更易复发，这也是其相对于鳞状乳头型颅咽管瘤更差的临床预后的根本原因之一。2在两种病理类型的颅咽管瘤当中，β-连接素的核聚集现象是造釉细胞型颅咽管瘤的特征性表现，可以作为临床及组织病理上区别两种病理类型的分子基础。3在造釉细胞型颅咽管瘤中，β-连接素核聚集在栅栏状细胞簇和呈指状突起的上皮细胞簇中，这种特殊的细胞分布与钙化上皮瘤和钙化的牙源性囊肿极相似。这似乎也暗示造釉细胞型颅咽管瘤和牙源性肿瘤在组织上、甚至起源上的类似之处。4颅咽管瘤的两种病理类型当中，仅造釉细胞型可以检测到β-连接素外显子3基因的突变，这可能与肿瘤的发生直接相关。可以认为，β-连接素基因突变在造釉细胞型颅咽管瘤的发生及发展中起重要作用。也间接提示从发生学上来讲，造釉细胞型颅咽管瘤与鳞状乳头型颅咽管瘤可能存在不同机理。