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目的:本实验通过间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)体外作用于人结肠癌SW480细胞,观察其上皮-间质转化(epithelial mesenchymaltransition,EMT)的相关蛋白表达改变情况,研究MSC对SW480细胞内信号蛋白/β-连环素(Wnt/β-catentin),信号通路的调控作用和对此通路相关靶基因基质金属蛋白酶-7(MMP-7),环氧化酶-2(COX-2),β-catentin的影响,探讨间充质干细胞对人结肠癌侵袭转移的影响及可能机制,为临床应用间充质干细胞治疗结肠癌提供理论依据。
方法:选取脐带血来源间充质干细胞,人结肠癌SW480细胞进行体外培养,收集3-8代间充质干细胞的培养上清液。将SW480细胞设立对照组与实验组,对照组细胞用DMEM培养液培养,实验组细胞分别用含20％、40％、80％浓度间充质干细胞培养上清液的DMEM培养液培养。1、采用MTT方法检测各实验组SW480细胞的抑制率,筛选受影响最明显时间;2、采用划痕实验法观察48小时内各组划痕愈合程度;3、流式细胞术(flowcytometry,FCM)分别定量测定48小时后对照组及各实验组人SW480细胞上皮-间质转化的标志蛋白E-钙黏着蛋白(E-cad)、N-钙黏着蛋白(N-cad)表达的变化。结合划痕实验及FCM结果筛选作用最明显浓度组;4、应用FCM检测40％浓度MSC上清液培养人SW480细胞48小时后Wnt/β-catentin信号通路下游靶基因MMP-7,COX-2表达情况。5、采用逆转录-聚合酶链反应(revers transcription PCR,RT-PCR)法验证40％实验组SW480细胞48小时后MMP-7,COX-2的表达改变,并检测上游基因β-catentin表达情况。
结果:
1 MTT结果显示:与对照组相比,各实验组培养24h后测得的抑制率分别为(47.0±8.3)％、(72.4±4.8)％、(78,3±4.7)％,与对照组相比均具有统计学意义(P＜0.01),且各实验组之间两两相比也具有统计学意义(P＜0.01)。于24h、48h、72h检测实验组抑制率,20％实验组抑制率由(47.0±8.3)％升至(56.0±3.8)％,40％实验组由(72.4±4.8)％升至(91.0±5.1)％,80％实验组由(78.3±4.7)％升至(93.3±4.9)％,均逐渐增高。各实验组组间相比48h与24h具有极显著性差异(P＜0.01),而各实验组在诱导72h后与48h相比抑制率无明显统计学意义(P＞0.05)。MTT实验结果:各实验组在作用48h时抑制效果最为显著。
2划痕实验结果显示:光镜下显示,MSC作用48h后,与对照组相比,不同浓度实验组SW480细胞迁移均减缓,对照组划痕较各实验组划痕明显变细。划痕宽度:对照组＜20％组＜40％组=80％组。说明MSC对SW480细胞迁移有一定抑制作用,且40％,80％实验组划痕在各时间点划痕宽度无明显改变。
3 FCM测定E-cad、N-cad表达结果显示:不同浓度MSC上清液与SW480细胞培养48h可使SW480细胞E-cad表达呈上升趋势、N-cad表达呈下降趋势,符合肿瘤细胞上皮-间质转化过程受到抑制时的分子表现。E-cad表达由1升至1.148,N-cad表达由1降至0.977,均具有统计学意义(P＜0.05)。20％实验组与其它实验组组间具有统计学差异(P＜0.05),但40％浓度组与80％浓度组之间无明显统计学意义(P＞0.05)。提示40％浓度组对SW480细胞影响最为显著。
4 FCM法检测加入40％MSC上清液实验组与对照组相比,48小时后SW480细胞中MMP-7蛋白表达由1降至0.965±0.007,COX-2蛋白表达由1降至0.89±0.0035,二者均具有显著性差异(P＜0.05)。
5 RT-PCR检测结果表明:含40％浓度MSC上清液培养液诱导SW480细胞48h后,与对照组相比,实验组SW480细胞中MMP-7的相对表达量由0.842降至0.19,COX-2的相对表达量由0.558降至0.165,β-catentin的相对表达量由0.660降至0.215,mRNA表达均呈下降趋势,且与对照组相比均具有统计学意义(P＜0.05)。
结论:
1本研究通过体外实验证实MSC可以抑制人结肠癌细胞SW480发生侵袭转移,主要与MSC抑制SW480细胞上皮-间质转化有关,为治疗肿瘤开辟了一条具有潜力的途径。
2进一步研究提示MSC抑制上皮间质转化的作用机制可能与抑制Wnt/β-catentin信号传导通路有关。
3本实验为临床应用间充质干细胞治疗结肠癌提供理论依据。