蒜氨酸酶性质及无臭脱水蒜片生产工艺研究

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大蒜中蒜氨酸酶(alliinase)是生成大蒜功能成分的关键酶,可催化S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜,即蒜氨酸(alliin)反应生成大蒜功能性物质。目前,有关温度、pH、E/S对蒜氨酸酶活性影响的研究较多,但有关金属离子对蒜氨酸酶活性作用机理的研究罕见报道。本研究以新鲜大蒜为原料,采用硫酸铵分级沉淀法、PEG6000沉淀法、葡聚糖G-200柱层析法提取分离蒜氨酸酶,用SDS-PAGE电泳鉴定其纯度,获得蒜氨酸酶提取分离纯化的适宜条件;利用正交试验、Box-behnken试验优化了金属离子对蒜氨酸酶活性影响的工艺参数;研究了金属离子对蒜氨酸酶反应动力学及紫外可见光谱的影响,初步探索了金属离子对蒜氨酸酶的激活与抑制机制。由于国内大部分热风干制蒜片产品品质较差,而高品质蒜片产品如冷冻干燥生产成本较高,本研究在单一干燥方式的基础上,采用真空微波-热风组合干燥技术研究开发高品质脱水蒜片。具体研究结果如下:1.蒜氨酸酶的提取分离对比实验表明,PEG6000沉淀法比硫酸铵沉淀法有更高的提取率,采用20%PEG6000纯化粗酶液,纯度是粗酶液的2.96倍,回收率达到72.75%;应用葡聚糖G-200柱层析纯化粗酶液,纯化后的酶液经SDS-PAGE电泳鉴定显示单一条带,凝胶成像系统分析其分子量约为54.7KD,这与文献报道值基本一致,说明本研究方法可有效纯化蒜氨酸酶。2.蒜氨酸酶性质研究在单因素试验的基础上进行正交及Box-behnken实验设计,优化金属离子激活蒜氨酸酶的参数,结果显示,E/S=0.20,反应温度36℃,pH为6.4,Mn2+浓度8.15mM时,蒜氨酸酶活性达到最大值,为0.156±0.0053umol/min。酶动力学试验结果显示,激活剂Mn2+使蒜氨酸酶的Km值、Vmax值变大,反应速度提高,这可能是Mn2+提供了适合蒜氨酸酶与底物反应的适宜环境,从而提高了反应速度;而抑制剂半胱氨酸使蒜氨酸酶Km、Vmax值减小,反应速度降低,这可能是因为半胱氨酸在这个反应体系中是一种反竞争性抑制剂,影响了酶与底物形成复合物向产物的转化,即反应过程中酶与底物结合形成中间复合物,复合物与反竞争性抑制剂半胱氨酸结合形成酶-底物-半胱氨酸复合物,而不能转化为产物,从而降低反应速度。紫外可见光谱试验结果显示,激活剂和抑制剂对特征吸收波长无影响,仅对吸收峰的大小有影响。添加激活剂Mn2+后,蒜氨酸酶在280nm、325nm以及430nm附近的吸收峰均变大;添加抑制剂半胱氨酸后,蒜氨酸酶在280nm、325nm附近吸收峰变大,在430nm处的吸收峰变小,这可能是因为激活剂和抑制剂影响了蒜氨酸酶辅助因子5’-磷酸吡哆醛的结构以及其与蒜氨酸酶主链的结合,从而影响了蒜氨酸酶的活性。初步探索了金属离子提高蒜氨酸酶活性的作用机制,探讨了蒜氨酸酶活性与大蒜素生成量的关系,结果表明蒜氨酸酶活性与大蒜素生成量呈正相关。3.无臭脱水蒜片的开发在护色与脱臭的基础上,采用真空微波-热风组合技术开发无臭脱水蒜片,以大蒜素含量、色值、复水率为指标,优化了组合干燥生产蒜片的最佳工艺参数:前期真空微波干燥20min(375w,真空度-90kpa),后期热风干燥60min(60℃),所得产品品质明显高于单一干燥方式的产品品质。
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