基于免疫PCR生物条形码技术检测多氯联苯的研究

来源 :上海交通大学 | 被引量 : 7次 | 上传用户:rachieyu
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
多氯联苯(PCBs)是一类人工合成的有机氯化合物,它具有优良的物理化学性质,曾经广泛的应用于工业生产中。虽然PCBs已经被禁止使用了近40年,但仍能在环境的各个角落检测到它的存在。PCBs在环境中难降解,并具有生物蓄积性和高毒性,给生态环境和人类健康带来了巨大的威胁。PCBs也因此成为各个国家和地区重点监测的污染物之一。目前检测PCBs的主要方法为气相色谱法,但该方法对样品前处理要求苛刻,所需仪器价格昂贵,检测成本高,检测周期长,不适合对样品的快速高通量分析检测。而免疫分析方法具有操作简单、成本低、灵敏度高、能够实现对目标分子的快速高通量分析检测等优点,目前已广泛的用于环境污染物的分析检测。因此,建立快速简便的免疫分析方法来检测PCBs具有重要的意义和广阔的应用前景。本文制备了三种分别针对PCB12、PCB37和PCB77的多克隆抗体和一种抗PCB37的单克隆抗体,在此基础上建立了检测PCB12、PCB37、PCB77的间接竞争酶联免疫吸附法(ic-ELISA);将制备的抗体进行生物素化处理,建立了检测PCBs的生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法(BA-ELISA);将不同的抗体和DNA修饰在金纳米颗粒(GNPs)表面,制备了多种抗体-GNPs-DNA探针,用于取代传统免疫PCR中的抗体-DNA结合物,基于这些探针,建立了基于实时荧光定量免疫PCR(rt-IPCR)的生物条形码方法(BCA)来检测环境中的PCBs。将这些方法用于实际环境样品中PCBs的分析检测,取得了满意的结果,为实现快速、高通量分析检测环境中的PCBs提供了可靠的技术支撑。主要研究结果如下:(1)以牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)为载体蛋白,分别用活化酯法和混合酸酐法制备了三种PCBs单体的人工免疫原和包被原,产物通过紫外光谱扫描分析确定半抗原与蛋白质成功偶联;通过免疫新西兰大白兔,制备了三种分别抗PCB12、抗PCB37和抗PCB77的多克隆抗体,所得的抗体特异性较好,效价较高,均能达到1:256000;本文还通过免疫小鼠,细胞融合,杂交瘤细胞培养,采集腹水,制备了抗PCB37单克隆抗体,和多克隆抗体相比,该抗体对PCB37的特异性更好。(2)利用所获得的抗体,分别建立了检测pcb12、pcb37和pcb77的ic-elisa方法。优化了抗原抗体浓度,温育时间,封闭液,有机溶剂,盐离子强度,ph值等实验条件,在最佳实验条件下,分别建立了检测pcb12、pcb37和pcb77的标准曲线;基于多克隆抗体,该方法对这三种pcbs单体的lod分别为0.016μgl-1、0.048μgl-1、0.063μgl-1。基于单克隆抗体,该方法对pcb37的lod为0.027μgl-1;将该方法用于海底沉积物样品中pcbs的分析检测,回收率均在81%-115%的范围内,变异系数(cv)均小于15%。(3)将抗体进行生物素化预处理,利用生物素-亲和素生物系统,分别建立了检测pcb12、pcb37和pcb77的ba-elisa方法。优化了包被原及生物素化抗体浓度,sa-hrp浓度,抗原抗体反应时间,生物素化抗体与sa-hrp反应时间等实验条件,同时还讨论了有机溶剂浓度,反应介质中ph值及盐离子浓度对实验的影响;在最佳实验条件下,分别建立了检测pcb12、pcb37和pcb77的标准曲线;基于多克隆抗体,该方法检测pcb12、pcb37和pcb77的ic50分别为0.53μgl-1,0.68μgl-1,1.36μgl-1;lod分别为4.5ngl-1、17ngl-1、18ngl-1;基于单克隆抗体,该方法检测pcb37的ic50为0.27μgl-1,lod8ngl-1;将建立的方法用于带鱼样品中pcbs的分析检测,加标样品中pcb12、pcb37和pcb77的回收率均在81%-113%之间,cv均小于15%。(4)分别用羊抗兔igg、羊抗小鼠igg及dna修饰15nm的gnps,制备了羊抗兔igg-gnps-dna和羊抗小鼠igg-gnps-dna两种gnps探针,用紫外扫描光谱和透射电镜(tem)对其表征,确定抗体和dna修饰在gnps表面。基于这两种gnps探针,分别建立了检测pcb12、pcb37、pcb77和aroclor1248的基于rt-ipcr的间接bca方法。该方法将包被原包被在戊二醛预处理过的pcr管上,让其和样品中的目标分子竞争抗体,与包被原结合的抗体保留在pcr管内,然后通过抗体与gnps探针表面的二抗结合,使得部分gnps探针附着在pcr管内,其他gnps探针则通过洗涤去除,在实时荧光定量pcr扩增阶段,条形码dna从gnps探针表面释放到pcr管内,并作为模板dna直接参与pcr扩增,通过测定条形码dna的量来间接检测样品中pcbs的含量。优化了退火温度,引物浓度,抗原抗体浓度,封闭液,gnps探针浓度,抗体与gnps探针反应时间等实验条件;在最佳实验条件下,基于羊抗兔igg-gnps-dna探针和抗pcb12、抗pcb37、抗pcb77、抗aroclor1248四种多克隆抗体,分别建立了检测pcb12、pcb37、pcb77、aroclor1248的标准曲线,其检测下限分别为2.63pgl-1,4.35pgl-1,1.72pgl-1,10.20pgl-1。基于羊抗小鼠igg-gnps-dna探针和抗pcb37单克隆抗体,该方法检测pcb37的lod为2.03pgl-1。将建立的方法用于小黄鱼样品中pcbs的分析检测,加标样品的回收率均在81%-112%之间,cv均小于15%。(5)分别用不同的抗体和dna修饰15nm的gnps,制备了五种gnps探针,抗pcb12抗体-gnps-dna,抗pcb37多抗-gnps-dna,抗pcb37单抗-gnps-dna,抗pcb77抗体-gnps-dna和抗aroclor1248抗体-gnps-dna,分别用紫外扫描光谱和tem对其表征,确保抗体和dna修饰在gnps表面;基于这五种gnps探针,分别建立了检测pcb12、pcb37、pcb77和aroclor1248的基于rt-ipcr的直接竞争bca方法。该方法将包被原包被在戊二醛预处理过的pcr管上,让其和样品中的目标分子竞争gnps探针上的抗体,一部分gnps通过包被原与抗体的特异性结合附着在pcr管内,其他gnps探针则通过洗涤去除,在实时荧光定量pcr扩增阶段,条形码dna从gnps探针表面释放pcr管内,并作为模板dna直接参与pcr扩增,通过测定条形码dna的量来间接检测样品中pcbs的含量。优化了金纳米探针浓度,封闭液,抗原抗体反应时间,有机溶剂浓度,反应介质中盐离子强度,ph值等条件,并在最佳实验条件下,分别建立了检测不同目标分子的标准曲线。该方法检测pcb12、pcb77、aroclor1248的检测下限分别为4.36pgl-1,9.12pgl-1,2.55pgl-1;基于多克隆抗体和单克隆抗体,该方法检测pcb37的检测下限分别为4.64pgl-1,3.15pgl-1;将建立的方法用于带鱼样品中pcbs的分析检测,加标样品回收率均在81-110%之间,cv均小于15%。总之,本文建立了ic-elisa、ba-elisa、基于rt-ipcr的间接竞争bca和基于rt-ipcr的直接竞争bca四种免疫分析方法来检测环境样品中的pcbs,这四种方法操作简便,快速,稳定性好,灵敏度高,样品检测结果与gc-ecd具有较好的相关性,能够用于实际环境样品中pcbs的快速高通量分析检测,具有较好的实际应用前景。
其他文献
通过产权制度改革,传统国企由单一投资主体转变为多元化投资主体,企业的产权结构也随之呈现出多元化,国企在竞争市场中实现了脱胎换骨式的变化,新国企现象横空出世。文章通过
改革开放40年以来,我国经济实现了年均近10%的增长速度,被称之为“中国奇迹”。其中,矿产资源作为国民经济发展的基础,为地区经济的腾飞做出了巨大贡献。但是,《十三五规划纲
中国位于环太平洋地震带和喜马拉雅、阿尔卑斯山的欧亚地震带两个地震带的包围中,是世界上地震活动最强烈和地震灾害最严重的国家之一。目前,我国对于地震灾害造成的家庭财产
奎因将同一性理解为事物不同名称间的外延关系,强调其作为殊相归纳基础和共相排除依据的功能,提出了倾向于理论优位的“没有同一性就没有实体”。斯特劳森基于经验确认的语言
<正>《数学课程标准》提倡评价目标的多维化、评价方法的多样化和评价主体的多元化,而笔试考卷作为其中的一元,虽然不是评价学生的唯一标准,但它依然是衡量学生学习成绩的有
目的探讨小夹板外固定在小儿骨折治疗中的临床应用效果。方法本次研究共有骨折患儿74例,平均分为观察组与对照组,各37例,观察组与对照组分别采用小夹板外固定治疗法与传统切
<正>前不久,浙江省法纪教育基地首次集中展示党的十八大以来查处的21名省管干部忏悔录手稿。从中不难发现,绝大部分违纪违法领导干部对第一次收受红包印象十分深刻,"贪欲大门
本文通过对北京市西城区18到35周岁的残疾青年进行抽样调查后发现,智能手机等新媒体在促进城镇残疾青年社会融入方面表现不一,具体来说:智能手机等新媒体在认知、态度、行为
近代以来东北地区的极端天气气候事件的形成与百年来该地区森林的毁灭性砍伐、蒙地草原的过度开发、城市化工业化废气的过度排放有密切关系。失去了森林覆盖的高山峻岭不能涵
冷战结束之后,美日同盟的不稳定性凸显,主要体现为军事同盟的性质无法满足当前时代的安全需要,内在的不平等性和"欠制度化"也使其效能不足。同时,日本国内政治的变化、美日国