促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)是真核细胞中一种重要的信号转导酶，对维持细胞正常生理功能起着极其重要的作用，深入研究植物寄生线虫MAPK的功能对线虫防治具有重要意义。 本研究克隆了南方根结线虫(MeloidogyneincognitaChitwood)MAPK基因MiMPK1，利用RNAi技术对线虫的卵块和2龄幼虫进行了离体干扰效应验证，并通过表达MiMPK1，基因片段dsRNA的转基因番茄植株对线虫进行了RNAi活体效应验证，为探讨MiMPK1基因的功能及其应用奠定了基础。 主要研究结果如下： 1.利用生物信息学筛选靶标基因的EST序列，采用RACE法从南方根结线虫体内克隆了目的基因cDNA全长序列，并进行深入分析。基因全长1358bp，包含1185bp的开放阅读框，编码一个含394个氨基酸的蛋白，预测蛋白分子量大约是45.4KDa，等电点6.5，GenBank登录号为DQ923592。生物信息分析表明，靶标基因即为MAPK基因MiMPK1。进一步研究确定了MiMPK1基因由5个外显子和4个内含子组成，为多拷贝基因。对MiMPK1基因进行原核表达，表达分子量与预测值相符。MiMPK1编码蛋白具有MAPK的11个保守结构域及磷酸化位点TEY模体，无跨膜结构，预测其三维结构具有高度保守性。进化分析表明，MiMPK1编码蛋白与人类和植物的亲缘关系较远，与小鼠和果蝇亲缘关系较近。 2.体外合成MiMPK1基因片段的dsRNA，利用浸泡法同时处理南方根结线虫的卵块和2龄幼虫，对其进行离体干扰效应验证。卵块浸泡在2mg/mldsRNA1天后，观察到孵化出的2龄幼虫数量明显多于对照组，但其死亡率却达到85％以上，而对照组的死亡率不高于5％；将孵化出的线虫和未孵化的卵块一同接种到番茄根部，45天后发现番茄根部没有根结和卵块，说明MiMPK1基因被沉默的幼虫无侵染力。卵块浸泡在2mg/mldsRNA3天后，孵化出的2龄幼虫死亡率几乎达到100％极显著高于对照组，但孵化出的2龄幼虫数量极显著低于对照组。2龄幼虫浸泡在2mg/mldsRNA6h后，线虫的活力明显下降；将处理的2龄幼虫接种到番茄根部，45天后发现番茄根部的根结和卵块数量与对照相比明显下降。RT-PCR分析表明靶标mRNA表达量明显降低。上述研究结果表明MiMPK1，基因在线虫的发育与寄生中具有关键作用。 3.通过植物介导沉默靶标基因对线虫进行RNAi活体效应研究。研究通过构建目的基因的dsRNA干扰表达载体，将MiMPK1基因和Mi-sf基因的片段分别正向和反向插入到载体中，得到表达目的基因dsRNA干扰载体pCAGC1341-TGPM02RNAi和pCAGC1341-TGAW01RNAi。根据已建立的高效快速农杆菌介导的遗传转化程序，通过农杆菌EHA105将构建好的载体转化番茄，获得了dsRNA干扰表达载体的转基因番茄。PCR扩增检测显示大多数转基因植株都能扩增出目的基因片段。对转基因番茄进行Southern分析，证明外源基因已成功整合到植物基因组中，RT-PCR验证外源基因高效表达。将2龄幼虫接种到T0代植株，14天后发现转基因番茄的根结数量极显著低于对照组，表达MiMPK1基因dsRNA的番茄与表达Mi-sf基因dsRNA的番茄相比，根结数明显减少，表明转基因番茄具有高效的抗虫作用，且转MiMPK1基因番茄的抗虫效果优于转Mi-sf基因的番茄。 充分说明MiMPK1基因在线虫的发育与寄生中具有关键作用，表明MiMPK1的dsRNA干扰在植物抗线虫的基因工程中具有应用价值，为南方根结线虫的防治提供了新的策略。