引言食管癌是全球第八大常见肿瘤,也是世界癌症相关死亡的最常见原因之一。统计结果显示,我国食管癌患者占全球患者总数的一半以上,男性和女性死亡率都居于全球首位,食管癌的治疗方案包括手术、化疗、放疗等。中晚期食管癌耐药性的产生是阻碍治疗效果的重要因素之一。肿瘤耐药的机制包括:(1)药物外排,减少肿瘤细胞内药物的浓度。(2)细胞凋亡阻滞。(3)DNA损伤修复应答。在肿瘤细胞中,耐药性的产生可能由一种或几种机制共同发挥作用,不同肿瘤细胞中的作用机制不同。外泌体是具有脂质双分子膜的纳米级囊泡,存在于所有体液中。肿瘤细胞分泌的外泌体参与多种细胞功能和生理病理事件。外泌体内容物包括mRNA、miRNA、蛋白质等,这些内容物都具有生物活性,能够在靶细胞中执行功能反应,而外泌体内容物miRNA与食管癌化疗耐药性的作用及其相关机制,目前尚不清楚。本实验通过食管癌细胞株TE1构建食管癌顺铂耐药细胞株TE1/DDP,并研究食管癌耐药细胞株TE1/DDP分泌的外泌体对敏感细胞株TE1顺铂敏感性的影响。通过对外泌体中的miRNA和处理细胞转录组进行高通量测序,利用生物信息学软件进行miRNA和mRNA关联分析,寻找与顺铂化疗耐药相关的miRNA,研究该miRNA对食管癌细胞生物学功能(增殖、凋亡、克隆形成能力、侵袭能力等)的影响,预测相关靶基因,分析其参与食管癌顺铂化疗耐药的机制。第一部分 顺铂耐药细胞外泌体对敏感细胞顺铂耐受性的影响目的构建食管癌顺铂耐药细胞株,研究食管癌顺铂耐药细胞株外泌体对顺铂敏感细胞株的影响。方法1.利用最低耐受浓度的顺铂处理食管癌顺铂敏感细胞株TE1,直至该细胞株对顺铂耐药,命名为TE1/DDP细胞株。2.利用CCK-8试剂盒和流式细胞术检测TE1/DDP细胞株在最低顺铂耐受浓度压力下的细胞活力和凋亡情况。3.利用超速离心法提取外泌体,透射电镜观察和Western blot检测鉴定提取的外泌体。4.通过CCK-8检测耐药细胞株外泌体干预敏感细胞后对顺铂耐受能力的影响。结果1.CCK-8试剂盒和流式细胞术检测结果显示,在IC50浓度(0.7 μg/mL)顺铂压力下,与TE1细胞株相比,TE1/DDP细胞株的活力显著升高(P<0.001),细胞凋亡显著降低,说明成功构建食管癌顺铂耐药细胞株TE1/DDP。2.在透射电镜下,可以看到食管癌外泌体呈典型的圆形或椭圆形杯状结构,大小为50-200 nm。Western blot检测结果显示,TE1/DDP细胞和TE1细胞外泌体均可以检测到CD63蛋白。3.CCK-8结果显示在添加TE1/DDP的外泌体(浓度:5.32×109/mL)后TE1细胞对顺铂的耐受性显著增加(P<0.05)小结成功构建了食管癌顺铂耐药细胞株TE1/DDP,其外泌体能够使敏感细胞TE1增加对顺铂的抵抗。第二部分影响敏感细胞耐药的外泌体miRNA及靶基因筛选目的通过高通量测序技术,对食管癌顺铂耐药细胞株TE1/DDP和顺铂敏感细胞株TE1中外泌体中的miRNA和耐药外泌体干预后细胞转录组进行测序,寻找与食管癌细胞顺铂耐药相关的miRNA和mRNA,研究其与食管癌患者生存率的关系。方法1.利用超速离心法提取外泌体,总RNA提取试剂盒提取外泌体中的总RNA,构建RNA测序文库进行高通量测序;提取细胞总RNA构建转录组文库,进行转录组测序;2.从测序数据中选取表达量显著差异的miRNAs进行荧光定量PCR验证;3.生物信息学软件关联分析miRNAs和mRNAs,预测与食管癌细胞顺铂化疗耐药的miRNAs。结果1.两组外泌体共有3182个miRNAs共靶标到69540个基因;其中在TE1组中973个miRNAs共靶标到67631个基因,在TE1-DDP组中561个miRNAs共靶标到65885个基因。2.差异表达统计分析结果显示,TE1组和TE1/DDP组的差异miRNAs共有493个,其中189个属于上调miRNAs,304个属于下调的miRNAs。3.TE1组和TE1/DDP组的差异基因共有5155个,其中3446个基因上调,1709个基因下调。4.生物信息学软件对mRNAs和miRNAs进行关联分析结果显示,ESR1基因和TP53基因位于关联分析网络的核心位点,且均与TFAP2C基因相关。5.荧光定量PCR检测结果显示,miRNAs在食管癌中的表达与测序数据中的表达量结果相一致。6.生存曲线分析结果显示,TFAP2C高表达的食管癌患者整体生存率高于TFAP2C低表达的患者;miR193高表达的食管癌患者整体生存率低于miR193低表达的患者。小结TFAP2C基因与食管癌化疗耐药相关,miR193和TFAP2C与食管癌患者的生存率相关。第三部分miR193参与食管癌顺铂化疗耐药的机制研究目的检测TFAP2C和miR193在不同食管癌细胞株中的表达,检测不同食管癌细胞中耐药相关基因的表达,验证TFAP2C和miR193的结合情况,构建TFAP2C过表达和miR193过表达食管癌细胞株;研究TFAP2C和miR193表达量变化对食管癌细胞增殖、侵袭能力、克隆形成能力和凋亡的影响。方法1.利用荧光定量PCR技术和Western blot技术检测TFAP2C和miR193在不同食管癌细胞和外泌体中的表达;2.利用双萤光素酶报告基因检测TFAP2C和miR193的靶向结合;3.利用慢病毒载体构建TFAP2C过表达和miR193过表达食管癌细胞株;4.利用EdU细胞增殖实验、流式细胞术、克隆形成实验、Transwell实验,研究TFAP2C和miR193表达量变化对食管癌细胞增殖、细胞周期、侵袭能力、克隆形成能力和凋亡的影响。5.采用Western blot检测与细胞周期及凋亡相关蛋白的表达水平;6.通过ChIP实验检测TFAP2C与P21基因启动子相互结合;结果1.荧光定量PCR检测结果显示,miR193在TE1细胞株外泌体中的相对表达水平显著低于在TE1/DDP细胞株外泌体中的相对表达水平,P<0.001;miR193在TE1细胞中的相对表达水平显著低于在TE1/DDP细胞中的表达水平(P<0.001),而加入TE1/DDP细胞株外泌体的TE1细胞(TE1/E)中miR193的相对表达水平显著高于TE1细胞,P<0.01。2.TE1/DDP细胞株中TFAP2C的相对表达水平显著低于TE1细胞株中的相对表达水平(P<0.001),而加入TE1/DDP细胞株外泌体的TE1细胞中TFAP2C的相对表达水平显著低于TE1细胞(P<0.01)。3.双萤光素酶报告基因检测结果显示,miR193与TFAP2C基因3’-UTR区相结合,提示TFAP2C是miR193的靶基因。4.细胞周期检测结果显示,TE1/DDP细胞株处于细胞周期G0/G1期的比例小于TE1细胞株,而TE1/DDP细胞株外泌体可以部分解除顺铂对食管癌细胞周期的阻滞作用;miR193过表达细胞株处于细胞周期G0/G1期的比例小于miR193过表达对照组,TFAP2C过表达细胞株处于细胞周期G0/G1期的比例大于TFAP2C过表达对照组。5.TE1/DDP细胞株中TFAP2C、TP53和P21基因的相对表达水平较低,EGFR和Cyclin D1基因的相对表达水平较高;而TE1/DDP细胞株外泌体可以改变这些基因在TE1细胞株中的相对表达水平。6.EdU增殖检测结果显示,在顺铂压力下,TE1/DDP细胞株增殖的细胞数显著大于TE1细胞株(P<0.01);TFAP2C过表达细胞株增殖的细胞数显著小于TFAP2C过表达对照组(P<0.01);miR193过表达细胞株增殖的细胞数显著高于miR193过表达对照组(P<0.01)。7.克隆形成实验结果显示,与TE1细胞株形成的克隆数相比,TE1/DDP细胞株的克隆形成数显著增多(P<0.01);与TFAP2C过表达对照组相比,TFAP2C过表达组细胞株的克隆形成数显著降低(P<0.05);与miR193过表达对照组相比,miR193过表达组细胞株的克隆形成数显著增多(P<0.01)。8.细胞凋亡实验结果显示,与TFAP2C过表达对照组细胞相比,TFAP2C过表达组细胞的凋亡率显著升高;与miR193过表达对照组细胞相比,miR193过表达组细胞的凋亡率显著降低;顺铂压力下miR193过表达组细胞的凋亡率显著高于正常条件下的miR193过表达组细胞。9.细胞侵袭实验结果表明,TFAP2C与miR193表达量变化对食管癌细胞侵袭能力没有显著性影响。10.ChIP实验得到的DNA中扩增获得了 P21启动子区的序列,由此可见TFAP2C能够与P21结合促进细胞周期的阻滞。小结1.TFAP2C基因是miR193调控的靶基因。2.TFAP2C过表达可以显著抑制食管癌细胞增殖、细胞周期和细胞克隆形成能力,促进细胞凋亡。3.TFAP2C能够与P21结合促进细胞周期的阻滞。miR193能够通过TFAP2C调节P21解除细胞周期阻滞。第四部分裸鼠荷瘤验证miR193促进食管癌细胞耐药目的在裸鼠体内移植瘤验证miR193对食管癌肿瘤细胞生长及顺铂敏感性的影响。方法1.将食管癌细胞悬液注射到裸鼠两侧腋下组织,每天观察接种肿瘤的结节生长情况,检测移植瘤在接种后1周、2周、3周、4周时的生长情况;2.所有实验动物均两侧植瘤。首先根据左侧植瘤细胞差异分为三组,右侧统一接种TE1细胞,左侧分别接种TE1、TE1/DDP、TE1/miR193。待两侧可触到明显结节后每组动物随机分为两个亚组进行顺铂干预,并以生理盐水为对照处理。3.生长4周后,颈椎脱臼法处死裸鼠,分离肿瘤实体,并进行拍照、称重、测量体积,做好记录,绘制肿瘤生长曲线。结果1.裸鼠荷瘤实验结果显示,TE1细胞株形成的肿瘤在顺铂压力下的肿瘤体积显著小于对照条件下的肿瘤体积(P<0.05)。2.TE1/DDP细胞株在顺铂压力下形成的肿瘤体积大小与正常对照组相比显著增大(P<0.05)。3.miR193过表达TE1细胞株在顺铂压力下形成的肿瘤体积大小显著小于正常对照组(P<0.05)。4.顺铂干预下,TE1/DDP细胞株形成的肿瘤大小显著大于TE1细胞株形成的肿瘤,miR193过表达TE1细胞株形成的肿瘤大小显著大于TE1细胞株形成的肿瘤。小结顺铂可以抑制食管癌肿瘤的生长,miR193过表达能够促进食管癌肿瘤的生长,增加其对顺铂的抵抗。结论1.食管癌耐药细胞外泌体能够增强顺铂敏感细胞TE1对顺铂的抵抗。2.TFAP2C基因是miR193调控的靶基因。3.TE1/DDP细胞株外泌体可以解除顺铂对食管癌的细胞周期阻滞作用。其机制是miR193的靶基因TFAP2C是P21的转录调节因子。顺铂可以抑制食管癌肿瘤的生长,miR193过表达能够促进食管癌肿瘤的生长,增加其对顺铂的抵抗。