糖尿病由于其并发症的危害已经逐渐成为了世界健康问题，糖尿病与许多慢性疾病的发生发展密切相关，如肥胖、非酒精性脂肪性肝病、动脉粥样硬化、高脂血症和骨质疏松等。既往研究已经发现慢性炎症，高脂血症和胰岛素抵抗间存在关联性，而“糖尿病是糖脂病”概念的提出进一步明确了糖尿病与脂代谢紊乱的关系，胰岛素抵抗(Insulin Resistance, IR)是2型糖尿病，肥胖，非酒精性脂肪性肝病，动脉粥样硬化等代谢性疾病发生的共同病理基础，同时也是这些疾病的共有特征。Toll样受体（Toll-like Receptor, TLR）是模式识别受体亚类中的一组蛋白质分子，广泛表达于先天免疫和适应性免疫系统的细胞上，在巨噬细胞，上皮细胞，内皮细胞，实质器官细胞，T细胞，B细胞，肥大细胞等细胞上均有其表达。TLR通过识别入侵的病原体介导感染所致的炎症，并且活化下游信号通路，促进前炎性因子标记基因产物表达。近期研究发现组织损伤释放的内源性细胞因子和饱和脂肪酸来源的内源性分子均可激活TLR，这说明TLR不仅介导感染导致的炎性反应，而且介导内源性分子诱导的炎症。在过去十年中，TLR与糖尿病发病机制的研究已逐渐成为研究热点之一，从临床研究和动物、细胞水平的实验证实TLR4与胰岛素抵抗和２型糖尿病发生密切相关，TLR9主要在１型糖尿病的发生中起作用，TLR2是否在２型糖尿病的发病中起作用仍然存在争议，TLR家族中的其他成员与糖尿病的发生至今研究不多，并且TLR家族与高脂血症的发生少见报道。因此本研究，我们首先测定了包括TLR1到TLR10的10种受体在2型糖尿病人群和高脂血症人群中的表达情况，并通过高脂饮食诱导胰岛素抵抗大鼠的实验模型，进一步了解大鼠骨骼肌TLR1到TLR10的基因及蛋白表达与胰岛素抵抗的关系，并初步探索药物干预对TLR家族的影响，为改善脂代谢对胰岛素抵抗的影响寻找新的靶点，本研究主要分为以下四部分。第一部分Toll样受体家族基因表达与高脂血症的关系目的：检测不同高脂血症人群外周血单核细胞TLR1-10的基因表达水平与正常人的差异。方法：临床样本来自河北省人民医院体检中心，高脂血症组182例，年龄26岁-45岁（35.55±4.77岁），其中男性113例，女性69例。根据血脂水平分为单纯高甘油三酯血症组（Hypertriglyceridemia Group, HTGgroup）43例，单纯高胆固醇血症组（Hypercholesterolemia Group, HTCgroup）84例，高胆固醇和高甘油三酯的混合型高脂血症组（MixedHyperlipidemia Group, MHL group）55例，另外选择与高脂血症组年龄、性别相匹配的健康体检者68例作为正常对照组（Control Group, Congroup），平均年龄34.68±4.27岁，其中男性40例，女性28例。收集所有受试者的身高，体重，腰围（Waist），并计算体重指数（Body Mass Index,BMI），同时采集受试者清晨空腹静脉血标本送检甘油三酯，胆固醇及其他生化项目，并留取静脉全血应用聚蔗糖泛影葡胺离心分层沉淀法分离外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs），然后用Trizol法提取总RNA并用RT-PCR的方法检测TLR1-10的mRNA表达情况。结果：1一般资料和生化指标比较单纯高甘油三酯血症组和单纯高胆固醇组及混合高脂血症组的性别，年龄，体重指数与正常对照组比较均无统计学差别（P>0.05），混合高脂血症组的腰围大于正常对照组，但两组间无统计学差异（85.29±9.42cm vs82.97±7.52cm, P>0.05），高胆固醇血症组和高甘油三酯血症组腰围分别为82.44±8.36cm和82.44±6.54cm，与对照组比较无明显差异（P>0.05），高甘油三酯血症组的甘油三酯水平明显高于正常对照组（2.66±0.45mmol/L vs0.87±0.30mmol/L, P<0.05），而高胆固醇血症组的胆固醇水平明显高于正常对照组（6.12±0.20mmol/L vs4.46±0.63,P<0.05），混合高脂血症组的胆固醇和甘油三酯均明显高于正常对照组（TC:6.20±0.30mmol/L vs4.46±0.63, P<0.05; TG:2.64±0.49mmol/L vs0.87±0.30mmol/L, P<0.05）。2外周血单核细胞TLR家族基因表达比较TLR1和TLR8的基因表达水平三组高脂血症人群均明显高于正常对照组，混合高脂血症组水平最高，其次为高胆固醇血症组，三组高脂血症人群TLR表达水平比较高甘油三酯血症组明显低于混合高脂血症组（TLR1:1.53±0.48vs2.13±0.86, P<0.05; TLR8:1.12±0.27vs1.48±0.42,P<0.05）。TLR2和TLR9的基因表达水平高脂组均明显高于正常对照组，但三个高脂组间比较无统计学差别。TLR3和TLR4在高脂组外周血单核细胞的基因表达水平均明显高于正常对照组（P<0.05），高脂组以高胆固醇血症组最高，统计学分析发现HTC组外周血单核细胞TLR3和TLR4的基因表达水平明显高于MHL组（TLR3:2.09±0.83vs1.67±0.49, P<0.05；TLR4:2.08±0.51vs1.63±0.41, P<0.05）TLR5-7在各组外周血单核细胞的基因表达均以混合高脂血症组最高，与其他三组相比均有显著差异（P<0.05），高胆固醇血症组和高甘油三酯血症组的水平也较正常对照组显著升高（P<0.05）。TLR10的表达三个高脂组也高于对照组，但混合高脂组与对照组比较无统计学意义（1.14±0.63vs1.03±0.30, P>0.05），并且三个高脂组间比较也无统计学差别。结论：1高脂血症人群外周血单核细胞的的TLR1-10基因表达水平均较对照组明显升高。2TLR1、TLR3、TLR4和TLR8主要与胆固醇水平升高有关；TLR5-7与胆固醇和甘油三酯升高均有关，并且胆固醇和甘油三酯升高对于TLR5-7有协同效应；TLR2和TLR9与高脂血症类型无关。第二部分Toll样受体家族基因表达与2型糖尿病的关系目的：探讨糖调节受损和2型糖尿病人群外周血单核细胞TLR1-10的基因表达水平与正常人的差异。方法：临床样本来自河北省人民医院体检中心，高血糖组104例，年龄26岁-47岁（34.39±4.78岁），其中男性67例，女性37例。根据血糖情况分为糖调节受损组（Impaired Glucose Regulation Group, IGR group）37例和2型糖尿病组（Type2Diabetic Mellitus Group, T2DM group）67例，另外选择年龄、性别相匹配的健康体检者68例作为正常对照组（Control Group, Con group）。收集所有受试者的身高，体重，腰围（Waist），并计算体重指数（Body Mass Index, BMI），同时采集受试者清晨空腹静脉血标本送检空腹血糖，空腹胰岛素及其他生化项目，并留取静脉全血待测基因水平，嘱患者正常进食早餐，并抽血检测餐后两小时血糖，外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）分离采用聚蔗糖泛影葡胺离心分层沉淀法，然后采用Trizol法提取总RNA并用RT-PCR的方法检测TLR1-10的mRNA表达情况。结果:1临床和生化指标比较2型糖尿病组和糖调节受损组两组受试者在性别，年龄，体重指数方面与正常对照组比较均无统计学差别（P>0.05），三组间的腰围比较也无统计学意义，且三组的腰围均数相似（T2DM:82.94±6.32cm; IGR:82.78±5.62cm; Con:82.97±7.52cm, P>0.05），无论空腹血糖还是餐后两小时血糖2型糖尿病组与糖调节受损组均明显高于正常对照组（P<0.05），并且与胰岛素抵抗指数的高低情况一致，2型糖尿病组HOMA-IR最高，达到1.98±0.33，糖调节受损组次之，为1.84±0.42，正常对照组最低（1.28±0.20）。2外周血单核细胞TLR家族基因表达比较TLR1-3，TLR6，TLR8和TLR9在糖调节受损组和２型糖尿病组的表达水平均明显高于正常对照组，并且２型糖尿病组与IGR组比较也显著升高；TLR4和TLR7在高血糖组外周血单核细胞的基因表达显著高于正常对照组，但２型糖尿病组与糖调节受损组比较则显著降低(TLR4:1.51±0.34vs1.70±0.41, P<0.05; TLR7:1.57±0.32vs1.71±0.41, P<0.05)；TLR5和TLR10在IGR组和T2DM组的水平显著高于正常对照组，2型糖尿病组的TLR5水平高于IGR组，但无统计学差别（1.46±0.46vs1.35±0.28, P>0.05），TLR10在IGR组和T2DM组的表达水平相似（1.24±0.30vs1.22±0.45, P>0.05）。分别以TLR1-TLR10为自变量，以HOMA-IR为因变量做直线相关分析，结果显示HOMA-IR与TLR1-9存在直线相关关系。结论：1TLR1-3、TLR6、TLR8和TLR9在糖尿病前期和2型糖尿病人群中的外周血单核细胞的基因表达均增加，且在2型糖尿病人群中的表达显著高于在糖尿病前期人群中的表达。2TLR4和TLR7在糖尿病前期和2型糖尿病人群中的外周血单核细胞的基因表达均增加，但在糖尿病前期人群中的表达显著高于在2型糖尿病人群中的表达。3TLR5和TLR10在糖尿病前期和2型糖尿病人群中的外周血单核细胞的基因表达均增加，但2型糖尿病人群和糖尿病前期人群比较无明显差别。4TLR1-9与胰岛素抵抗密切相关。第三部分高脂饮食大鼠骨骼肌Toll样受体家族的表达与胰岛素抵抗目的:应用高脂饮食干预的方法造就胰岛素抵抗大鼠实验模型，检测其胰岛素敏感组织骨骼肌的TLR1-10的表达水平，探讨骨骼肌TLR的表达与胰岛素抵抗的关系。方法：雄性SD大鼠48只，体重120-150g，适应性喂养2周后，随机分为正常对照组（Control group, Con group）16只和高脂组（High-fat dietgroup, HF group）32只，对照组给予基础饲料，高脂组给予高脂饲料，普通饲料和高脂饲料的原料均购自河北医科大学实验动物中心，自行按配方配置高脂饲料，基础饲料热量构成比为碳水化合物65.5%，脂肪10.3%，蛋白质24.2%，；高脂饲料热量构成比为碳水化合物和蛋白质各20.1%，脂肪59.8%，所有大鼠均自由进食与饮水。干预6周后每组随机抽取6只进行清醒状态下的高胰岛素正常葡萄糖钳夹试验计算葡萄糖输注率(Glucose Infusion Rate, GIR)评价胰岛素敏感性，同时留取血样检测血甘油三酯（Triglyceride, TG）、总胆固醇（Total Cholesterin, TC）、高密度脂蛋白（High Density Lipoprotein， HDL）、低密度脂蛋白（Low DensityLipoprotein, LDL）和极低密度脂蛋白（very Low Density Lipoprotein,VLDL），冻存骨骼肌组织待测TLR基因和蛋白表达水平，基因检测采用RT-PCR的方法，蛋白检测采用Western blot方法。结果：1两组间体重、空腹血糖和GIR比较分组喂养6周后两组比较高脂组的体重和空腹血糖均明显高于普通饲料对照组（485.99±22.32g vs450.83±25.94g, P<0.05;5.26±0.48mmol/L vs4.28±0.42mmol/L, P<0.05）。高脂组的GIR明显低于正常对照组（14.09±1.40mg/Kg/min vs27.14±0.73mg/Kg/min, P<0.05），另外检测血脂发现高脂组的TC、TG、LDL、VLDL水平均明显高于对照组，而HDL水平则低于对照组，继续高脂干预8周发现14周后高脂组无论体重还是血糖均更高于对照组，14周与6周相比，无论对照组还是高脂组14周的体重和血糖均高于6周，且达到了统计学差异（P<0.05），而血脂水平比较两组的血脂水平在14周时变化不大，仅正常对照组的LDL和VLDL有显著升高（LDL:0.41±0.02mmol/L vs0.35±0.02mmol/L, P<0.05;VLDL:0.16±0.05mmol/L vs0.07±0.02mmol/L, P<0.05），两组的GIR14周和6周比较高脂组的GIR减低更为明显（11.72±1.64mg/Kg/min vs14.09±1.40mg/Kg/min, P<0.05）而对照组则无明显变化（27.49±1.23mg/Kg/min vs27.14±0.73mg/Kg/min, P>0.05）。2大鼠骨骼肌TLR基因表达水平比较高脂组大鼠骨骼肌的TLR1-10基因表达在6周和14周时均较正常对照组显著升高，14周与6周比较高脂组TLR1，TLR5，TLR7和TLR8的基因表达水平无明显变化，高脂组TLR2和TLR4在14周时的水平较6周时下降而TLR3，TLR6，TLR9和TLR10则升高，但这种变化均无统计学差异（P>0.05）。3大鼠骨骼肌TLR蛋白表达水平比较无论是6周还是14周，高脂组大鼠骨骼肌的TLR蛋白水平均高于正常对照组，但在6周时TLR5的蛋白表达水平在两组间的差异无统计学意义（1.17±0.24vs0.96±0.06，P>0.05）。高脂组骨骼肌TLR1-3，TLR5，TLR6和TLR10的蛋白的表达水平在14周时明显高于6周，并且TLR1和TLR6的差异具有统计学意义（TLR1:1.75±0.24vs1.34±0.21,P<0.05; TLR6:1.99±0.23vs1.30±0.17, P<0.05）。14周时高脂组骨骼肌的TLR4和TLR7-9表达水平较6周时下降，并且TLR7与TLR8差异显著（TLR7:1.27±0.18vs1.66±0.17, P<0.05; TLR6:1.49±0.19vs1.96±0.21, P<0.05）。结论：1高脂饮食干预6周可导致大鼠血脂水平升高，葡萄糖输注率明显降低，形成胰岛素抵抗大鼠动物模型。2高脂诱导的胰岛素抵抗大鼠骨骼肌的TLR1-10基因和蛋白表达水平均显著升高，TLR1和TLR6与胰岛素抵抗的程度更为密切，随高脂喂养时间延长而逐渐增加。第四部分药物干预对高脂饮食大鼠骨骼肌Toll样受体家族表达的影响目的：通过改善胰岛素抵抗的药物干预，进一步了解TLR家族与胰岛素抵抗和血脂紊乱的关系，以探索治疗胰岛素抵的新靶点。方法：于造模成功时即高脂干预6周时，正常对照组剩余大鼠继续给予普通饲料作为对照组（Control group, Con group），高脂组随机分为高脂对照组（High-fat diet group, HF group），津力达干预组（Jin Li Da group,JLD group）和吡咯列酮干预组（Pioglitazone group, Ptz group），津力达组给药剂量为1.5g/Kg.d，吡咯列酮组给药剂量4.5mg/Kg.d，津力达和吡咯列酮均捣碎后用0.5%的羟甲基纤维素钠溶解后进行灌胃给药，津力达药物浓度为0.375g/ml，吡咯列酮药物浓度为1.125mg/ml，正常对照组和高脂对照组给予0.5%的羟甲基纤维素钠4ml/Kg.d灌胃以除外灌胃操作对大鼠的影响；动物饲养每笼2只，明暗周期为12h（6am-6pm），室温20℃-23℃。普通饲料及高脂饲料的原料均购自河北医科大学实验动物中心，高脂饲料的配比为每公斤饲料含饲料配比为每公斤饲料含面粉100g、豆粕330g、大豆粉200g、鱼粉20g、猪油300g、麸皮20g、骨粉30g，基础饲料热量构成比为碳水化合物65.5%，脂肪10.3%，蛋白质24.2%；高脂饲料热量构成比为碳水化合物和蛋白质各20.1%，脂肪59.8%，所有大鼠均自由进食与饮水。干预8周后所有大鼠进行清醒状态下的高胰岛素正常葡萄糖钳夹试验计算葡萄糖输注率(Glucose Infusion Rate, GIR)评价胰岛素敏感性，同时留取血样检测血甘油三酯（Triglyceride, TG）、总胆固醇（Total Cholesterin, TC）、高密度脂蛋白（High Density Lipoprotein,HDL）、低密度脂蛋白（Low Density Lipoprotein, LDL）和极低密度脂蛋白（very Low Density Lipoprotein, VLDL），冻存骨骼肌组织待测TLR基因和蛋白表达水平，基因检测采用RT-PCR的方法，蛋白检测采用Westernblot方法。结果：1各组间体重、空腹血糖和GIR比较药物干预前高脂组和药物干预组的体重均明显高于正常对照组，而与高脂组比较药物干预组和高脂对照组间无统计学差异；药物干预8周高脂组和药物干预组体重仍显著高于正常对照组，但两个药物干预组的体重则较高脂对照组明显降低。HF组，JLD组和Ptz组的空腹血糖均明显高于正常对照组，14周时正常对照组和高脂组及津力达组的空腹血糖均有所升高，而吡咯列酮组的血糖较6周时下降，统计学发现各组的变化均达到了统计学差异。14周各组的血糖比较发现高脂组和津力达组明显高于正常对照组，津力达组与高脂对照组比较无明显差别（6.25±0.19mmol/L vs6.32±0.27mmol/L, P>0.05），吡咯列酮药物干预组与对照组比较稍有升高，但无统计学差别（5.15±0.45mmol/L vs4.97±0.25mmol/L, P>0.05）。清醒状态下高胰岛素正葡萄糖钳夹试验测定两组的葡萄糖输注率发现高脂组的GIR明显低于正常对照组（11.72±1.64mg/Kg/min vs27.49±1.23mg/Kg/min, P<0.05），津力达干预组的GIR明显高于高脂对照组，与正常对照组比较无统计学差异（28.10±1.77mg/Kg/min vs27.49±1.23mg/Kg/min, P>0.05），吡咯列酮干预组的胰岛素敏感性最高，GIR达到了31.27±1.40mg/Kg/min，与正常对照组比较差异显著（P<0.05）。2药物干预8周后各组的血脂比较高脂组的TC、TG、LDL、VLDL水平均明显高于正常对照组，而HDL水平较对照组明显减低（P<0.05）。津利达和吡咯列酮干预后高脂组的血脂情况均有明显改善，津利达给予每日每公斤体重1.5g可以明显降低高脂组的TC、TG、LDL、VLDL水平，并且升高HDL水平。吡咯列酮组的TC、TG、LDL、VLDL水平也较高脂对照组明显降低，而HDL较高脂对照组明显升高(0.48±0.02mmol/L vs0.4±0.02mmol/L, P<0.05)。总体来看吡咯列酮对血脂的改善作用弱于津利达。3药物干预8周后各组骨骼肌TLR基因表达水平比较高脂组与对照组比较骨骼肌TLR1-10的基因表达水平均明显升高，JLD组和Ptz组的TLR基因表达水平较高脂组明显下降，并且津利达组的TLR3，TLR4和TLR6的水平虽然高于Con组，但无统计学差异（P>0.05），Ptz组与正常对照组比较所有TLR基因表达水平均升高，但只有TLR2和TLR7，TLR8达到了统计学差异。4药物干预8周后各组骨骼肌TLR蛋白表达水平比较高脂组骨骼肌TLR蛋白表达水平较Con组升高，但TLR7的差异无统计学意义（1.27±0.18vs1.02±0.06, P>0.05），JLD组和Ptz组与高脂组比较TLR1-10均降低，但TLR5，TLR7和TLR10的差异无统计学意义（P>0.05），进一步比较发现吡咯列酮组的TLR1-4和TLR8、TLR9水平较津力达组更低，而TLR6的水平津力达组和吡咯列酮组相似（1.47±0.16vs1.46±0.33）。结论：1吡咯列酮和津力达均能显著改善高脂饮食大鼠的血脂升高和胰岛素抵抗，但津力达对血脂的改善作用优于吡咯列酮，而对胰岛素抵抗的改善作用则弱于吡咯列酮。2吡咯列酮能显著降低高脂饮食大鼠骨骼肌TLR家族的基因和蛋白表达水平，且对TLR1-4和TLR6-8表达的影响更加明显。津力达的干预效果与吡格列酮一致。