喹赛多是喹噁啉类抗菌促生长类饲料添加剂。早先上市的喹嗯啉类药物如卡巴氧和喹乙醇在上世纪中后期曾广泛应用于养殖业的各个环节,但随后的毒理试验证明它们都具有明显的三致作用,严重威胁动物和人类健康。目前的毒理研究已经表明喹赛多的无光敏、致畸、生殖和蓄积毒性,在猪和鸡的安全性非常高,可成为新的喹噁啉类替代药。目前关于喹赛多代谢酶的研究还很少见,而药物的毒理、药理作用都与其原型药物在机体内的代谢及残留息息相关,因此加强对喹赛多体内代谢过程中相关酶的研究就显得刻不容缓了。喹赛多代谢关键酶的研究不仅有助于喹赛多作为一类新兽药的申报,更能指导喹赛多在食品动物中的合理使用,帮助制定合理的休药期,从而避免了有害残留的出现,为人类的食品健康保驾护航。黄嘌呤氧化还原酶(XOR)是含钼类酶家族的一员,在动物体内各组织中分布广泛,主要是参与哺乳动物体内次黄嘌呤代谢成黄嘌呤和黄嘌呤氧化代谢为尿酸的生理过程。XOR主要分布在组织细胞胞浆中,在肝细胞浆中展示了重要的氧化还原活性,是除P450酶之外最重要的药物代谢酶之一。XOR具有很强的还原代谢能力,主要参与了硝基、氮氧化物和硫氧化物等基团的还原。由于喹赛多1位和4位的氮氧化物的还原产物都是喹赛多在动物体内代谢的主要代谢产物,已有的研究证明了喹赛多跟猪胞浆蛋白孵育后会发现代谢,推测XOR极有可能在喹赛多的脱氧还原代谢中扮演重要角色。本研究首先用XOR特异性抑制剂确定XOR是喹赛多的代谢酶,然后克隆猪肝细胞XOR基因,并选择合适的体外表达系统对猪XOR进行重组表达,研究重组XOR的酶学性质。为了研究XOR催化喹赛多代谢的机理,利用同源建模和分子对接技术确定XOR代谢喹赛多的关键氨基酸残基,利用定点突变技术,异源表达并鉴定突变体的代谢活性,展示关键氨基酸残基对其代谢能力的影响,并分析XOR结构与功能的关系。1.猪XOR代谢喹赛多的验证差速离心法制猪肝细胞胞浆蛋白,与喹赛多进行体外孵育,并用XOR特异性抑制剂作用,HPLC检测代谢产物。体外代谢试验可以明显的看到猪肝细胞胞浆蛋白代谢喹赛多,XOR特异性抑制剂作用后可以看到明显的抑制作用,说明猪肝脏胞浆蛋白中的XOR可以代谢喹赛多。2.猪XOR基因的克隆、表达和活性鉴定用Trizole法提取肝细胞总RNA,反转录酶反转录获得cDNA,再以cDNA为模板,参照其它哺乳动物同源性较高的序列设计引物,分两段扩增XOR基因,然后酶切连接获得完整CDs序列。用pFastBac HTb载体构建重组质粒,转座到杆粒中,然后转染到杆状病毒中,获得含有XOR编码序列的重组病毒。Sf9被杆状病毒感染后表达XOR蛋白。Western blot验证表达结果,蛋白胶灰度确定重组蛋白含量。测定XOR代谢动力学参数(最大初速度Vmax、米氏常数Km和体外清除率CLint)。表达载体pFastBac HTb-XOR酶切结果证明目的基因克隆成功,XOR编码序列测序后上传到NCBI核苷酸库中,序列号是JN896312.1。重组蛋白体外代谢结果表明,重组蛋白是以活性形式存在于Sf9细胞中。重组XOR代谢喹赛多的Km值是代谢黄嘌呤的2.7倍,而Vmax只有后者的1／5,对黄嘌呤的Clint值是喹赛多的近15倍。说明相对于喹赛多,猪XOR对黄嘌呤的结合能力更强,催化效率更高,代谢能力更强。3.猪XOR代谢喹赛多的关键氨基酸的确定利用分子生物学网站,分析蛋白质二级结构,并根据牛XOR晶体结构为模板进行同源建模。将喹赛多作为配体,XOR作为受体进行分子对接,得到喹赛多代谢关键氨基酸残基。二级结构预测结果显示,猪XOR跟牛XOR的二级结构十分接近。结构域预测结果说明,该酶的功能区域保守性非常高,分别由含铁硫中心的结构域(20kDa)、含FAD的结构域(40kDa)和含钼辅助因子的结构域(85kDa)三部分组成。同源建模结果可信程度很高,对模型评价DOPE Score是-157326.5625,Verify Score为616.831。Ramachandran Plot图结果显示,91.5%氨基酸都分布在蓝色最适区域,5.7%氨基酸位于紫色可信区域,2.8%氨基酸位于可疑区域。将喹赛多与XOR模型对接后找到与喹赛多发生相互作用力的G47、N352、$360、R427、D430、D431、S1227和K1230八个氨基酸残基。这八个氨基酸距离喹赛多都不超过4A,其中R427、D431、S1227和K1230与喹赛多形成了氢键结合,其余四个氨基酸形成了其它非共价键结合。分子对接模拟结果显示,这些氨基酸残基都与喹赛多催化过程息息相关,能显著改变XOR对喹赛多的代谢能力。4.点突变对XOR代谢喹赛多的影响构建突变体表达载体,重组表达XOR突变体,并与喹赛多孵育评估突变对酶代谢喹赛多能力的影响。动力学分析结果显示,XOR突变体代谢黄嘌呤时,D430H和D431A能增加CLint值,S360P、S1227A和K1230A能降低CLint值,说明这些氨基酸残基与黄嘌呤代谢能力关系密切。同时,这些位点的突变也改变了酶对底物亲和性和Vmax值,D431A能显著增加Vmax,S360P、S1227A和K1230A对黄嘌呤亲和性明显降低,说明这些位点与底物结合位点关系密切。XOR突变体代谢喹赛多结果显示,XOR代谢喹赛多的能力不及代谢黄嘌呤1/10,R427E和D431A能增强CLint值,即能增强喹赛多代谢能力,S360P、D430H、S1227A和K1230A代谢喹赛多能力下降。R427E底物亲和性明显增强,S360P、S1227A和K1230A的Km值明显增大,说明底物亲和性减弱明显,这些都说明这些氨基酸残基与喹赛多代谢作用相关。综上所述,本研究在体外重组表达了喹赛多在猪体内的代谢关键酶-黄嘌呤氧化还原酶(XOR),并对该酶进行了同源建模和分子对接模拟研究,确定了8个与喹赛多代谢相关的氨基酸。通过对这些氨基酸进行定点突变研究,一定程度上揭示了XOR代谢喹赛多的结构与功能关系及分子催化机制,为喹赛多在猪体内的代谢提供了理论依据。此外,本研究建立的重组酶体外代谢体系为新药研发提供了一个稳定的代谢系统,也为其它的新药研发提供了一种科学策略。