枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种重要的革兰氏阳性模式菌,其表达系统在酶工程、代谢工程、分子生物学研究等领域被广泛应用。枯草芽孢杆菌能够高效利用甘油,且其对甘油的利用受到碳代谢阻遏的严格调控。枯草芽孢杆菌来源的抗终止蛋白GlpP（BsGlpP）是枯草芽孢杆菌甘油代谢途径的调控元件,其能够特异性结合甘油-3-磷酸（glycerol-3-phosphate,G3P）,进而破坏终止子功能,在转录水平激活基因表达。本研究首先通过三级结构分析,解析了BsGlpP的工作机制。在此基础上,利用该元件构建了甘油诱导表达系统（glycerol-induced expression system,GIES）。并通过葡萄糖-甘油复配培养基的开发,实现GIES高效自诱导表达外源蛋白。具体内容如下:（1）GIES系统的构建及表征。以受BsGlpP调控的启动子PglpD,及绿色荧光蛋白sfGFP基因构建表达系统。通过添加不同的碳源作为诱导剂,证明该系统受到甘油的特异性诱导,且外源蛋白表达水平较高。将该系统分别构建至不同复制类型的载体上,表明其在不同的遗传环境中具备较强的鲁棒性。（2）基于分子动力学模拟解析BsGlpP的工作机制。通过同源建模和分子对接得到BsGlpP与配体G3P结合的3D模型,确定了配体结合口袋。丙氨酸扫描结果显示R14、R104和R157为配体结合的关键氨基酸。通过分子动力学模拟解析BsGlpP结合G3P前后的构象变化,发现RNA结合区域中HG和HF从“平行”到“交叉”的结构变化,是BsGlpP发挥抗终止作用的关键。（3）通过葡萄糖-甘油复配,实现GIES高效自诱导表达外源蛋白。在培养基中复配葡萄糖和甘油,基于枯草芽孢杆菌严谨的碳代谢阻遏效应,在葡萄糖耗尽后,甘油作为碳源被利用,并诱导GIES表达外源蛋白。进一步研究表明,在该自诱导方式中,改变葡萄糖的添加量,可控制基因开启表达的时间;改变甘油的添加量,可控制基因表达的水平。（4）利用GIES的自诱导培养,在5 L发酵罐内实现纳豆激酶的高效表达。首先,在摇瓶水平确定1%甘油复配0.1%葡萄糖为纳豆激酶表达的最佳配比。在此基础上,在5 L发酵罐中分别进行分批发酵及补料发酵。分批发酵过程中20 h纳豆激酶酶活达到最高(10.25 U·m L-1),是摇瓶水平的6倍;补料发酵酶活最高达到11.90 U·m L-1,是摇瓶水平的6.90倍。