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脑卒中是当今世界严重危害人类健康的疾病之一,已成为我国城乡居民最主要的死亡病因。且多数患者预后较差,严重影响其生存质量,同时也给家庭及社会带来了沉重的负担。在脑卒中的病理过程中,神经元细胞的损伤是影响疾病进展及预后的重要原因。其损伤机制涉及氧化应激,炎症发应,兴奋性神经毒性,钙超载等。在诸多损伤因素中,谷氨酸盐的过度释放及其伴随的氧化应激损伤扮演了至关重要的角色。因而寻找一种合适的神经元细胞保护方案以有效抑制其损伤作用成为当前重要的研究方向。脂联素是一种主要由脂肪细胞分泌的细胞因子。已经表明,APN可以增加外周组织对胰岛素的敏感性,具有抗糖尿病和抗动脉粥样硬化作用。此外,许多证据表明APN在心脏和大脑缺血/再灌注损伤中具有一定的保护作用。然而关于APN如何减轻急性脑缺血中的兴奋性毒性和脑损伤,详细的机制尚有待探讨。即使人源APN已经成功合成,因其分子量较大难以通过血脑屏障,故而限制了其通过静脉注射的方式发挥脑保护作用。在之前的相关研究中多采用APN敲除小鼠,腺病毒介导或侧脑室注射等方式。而本研究中我们选用一种拟脂联素多肽,其根据APN氨基酸序列进行合成并能有效模拟APN功能。该多肽已申请中华人民共和国知识产权局专利,且相关结果显示,实验小鼠腹腔注射或尾静脉注射后其可有效通过血脑屏障与脑内APN受体结合发挥拟APN效应。沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)是一种依赖于烟酰腺嘌呤二核苷酸(nicotine–amid adenine dinucleotide,NAD)的去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)。许多研究表明,SIRT1可以参与细胞的代谢、增殖、衰老和损伤修复过程,而且SIRT1可直接或间接在抗细胞凋亡和抗炎过程中起到关键作用。有研究表明,SIRT1的激活可以减轻败血症引起的神经炎症,细胞凋亡和氧化应激损伤。且值得注意的是,一项关于胰腺癌进展的研究表明,APN可以通过激活AMPK/SIRT1/PGC-1α相关信号减轻胰岛β细胞凋亡。此外,调节APN受体1(AdipoR1),诱导AMPK/SIRT1激活可以改善阿尔茨海默病的神经病理学缺陷。然而,在脑卒中后APN发挥神经保护过程中,SIRT1的确切作用尚未被完全了解。本研究旨在阐明APN与SIRT1/PGC-1α途径之间的关系及其在Glu诱导的脑损伤氧化应激中的作用。方法:本研究选用小鼠海马神经元HT22细胞为实验对象,以谷氨酸盐诱导兴奋性氨基酸毒性从而构建HT22细胞氧化应激损伤模型。将实验细胞分为对照组,损伤组及不同浓度脂联素多肽预处理组。采用MTT法检测各组细胞活力,LDH法检测各组细胞损伤程度;采用Tunel染色及Western Blot技术检测各组细胞凋亡率及相关凋亡蛋白表达情况;采用ROS染色及MDA、SOD、GSH-px试剂盒检测各组细胞氧化应激水平;采用免疫荧光技术及Western Blot技术检测各组细胞SIRT1及PGC-1α表达水平;采用SIRT1 siRNA转染技术验证脂联素多肽、SIRT1、PGC-1α在HT22细胞氧化应激损伤中的保护作用及三者之间相互作用关系。结果:HT22细胞给予不同浓度脂联素多肽处理24h,MTT及LDH实验结果显示其对细胞无明显的毒性作用,Western Blot结果显示SIRT1及PGC-1α表达量可随脂联素多肽处理浓度增加而上升。而细胞给予谷氨酸盐(5mM,24h)处理后,同对照组相比,损伤组细胞活力下降,LDH释放量增加。而细胞给予不同浓度脂联素多肽(100μM,250μM,500μM)预处理6h后,细胞活力较损伤组显著回升,LDH释放也受到抑制;TUNEL染色结果显示:谷氨酸盐处理后损伤组细胞凋亡率显著增加,而脂联素多肽预处理后,细胞凋亡率呈浓度依赖性下降,且在脂联素多肽500μM时,凋亡率可明显降至20.33±4.76%。与此同时我们检测了各组细胞Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3水平,结果显示同损伤组相比,脂联素多肽预处理可明显下调cleaved caspase-3表达并且降低Bax/Bcl-2比值。综合以上实验结果我们可以看出:在HT22细胞中脂联素多肽可发挥抗谷氨酸盐损伤、抗凋亡的作用。ROS染色结果显示:经谷氨酸盐处理后细胞ROS水平较对照组显著增加,而给予脂联素多肽处理可逆转此变化且呈浓度依赖性。丙二醛及相关抗氧化酶结果亦显示:不同浓度脂联素多肽处理后,可减少谷氨酸盐导致的细胞内氧化应激代谢产物积聚,恢复受抑制的抗氧化酶表达水平。可见脂联素多肽具有减轻HT22细胞氧化应激损伤的作用,且该能力可随给药浓度增加而增强。而western blot结果显示损伤组SIRT1和PGC-1α表达量显著降低,而给予不同浓度脂联素多肽处理后,SIRT1和PGC-1α蛋白量均可随浓度增加而上升。而免疫荧光实验可见,经过脂联素多肽处理后,胞质内两种蛋白表达量均显著上升。而HT22细胞给予SIRT1 siRNA干扰后,可阻断细胞SIRT1表达,并逆转了脂联素多肽的抗谷氨酸盐损伤保护作用及对PGC-1α的上调。结论:1、在HT22细胞中,脂联素多肽可以发挥抗谷氨酸盐诱导氧化应激损伤、减轻细胞凋亡。2、在HT22细胞中,脂联素多肽可以通过激活SIRT1/PGC-1α通路发挥抗谷氨酸盐损伤保护作用。