羟基红花黄色素A延缓高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化及其机制研究

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目的:慢性肾脏病(CKD)是一种危害全球健康的严重疾病。矿物质骨代谢异常导致的血管钙化(vascular calcification)是其特有而常见的合并症,是CKD患者心血管事件的重要原因,导致患者全因心血管死亡率显著增加。羟基红花黄色素A是中药红花的主要药效成分之一。红花的药效作用包括抗炎,抗凋亡和抗氧化。本研究拟探索羟基红花黄色素A能否改善β-磷酸甘油诱导的大鼠血管平滑肌细胞钙化及其可能的机制。研究方法:实验分为3组:对照组(NC)、高磷诱导钙化组(HP)、HSYA干预组(HSYA)。CCK8法检测羟基红花黄色素A对大鼠血管平滑肌细胞生存活力的影响。钙测定试剂盒(邻甲酚酞络合酮比色法)检测10^-9mol/L至10^-5mol/L的不同浓度HSYA对细胞中钙沉积量的影响。Westernblot法检10^-8mol/L至10^-4mol/L不同浓度羟基红花黄色素A对大鼠血管平滑肌细胞钙化表型分子Runt相关转录因子2(RUNX2,Runt-related transcription factor 2)的改变。茜素红染色法检测各组细胞钙结节的差异。Westernblot检测细胞钙化指标碱性磷酸酶(ALP,Alkaline Phosphatase),Runt相关转录因子(RUNX2,Runt-related transcription factor 2),核因子κB受体活化因子配体(RANKL,Receptor Activator of Nuclear Factor-kB Ligand),α平滑肌肌动蛋白(α-SMA,Alpha-smooth muscle actin),及TLR4/NF-κB通路指标和炎性反应相关指标Toll样受体4(TLR4,Toll-like receptor 4),白细胞介素8(IL-8,Interleukin-8),肿瘤坏死因子α(TNF-α,Tumor Necrosis Factor-Alpha)的变化。细胞核蛋白与细胞质蛋白抽提试剂盒分别提取细胞核蛋白和细胞质蛋白,Westernblot法检测细胞核内核因子-KB(NF-κB p65,Nuclear Factor Kappa-B,P65)和细胞质NF-κB p65,及细胞总蛋白中NF-κB p65和磷酸化的NF-κB p65的改变。免疫荧光法观察各组细胞内NF-κB的表达。PCR法检测炎症指标IL-1β(IL-1β,Interleukin-1β),IL-6(IL-6,Interleukin-6)的表达。活性氧自由基(ROS,Reactive Oxygen Species)试剂盒,超氧化物歧化酶(SOD,Superoxide dismutase)试剂盒、丙二醛(MDA,Malondialdehyde)试剂盒检测细胞抗氧化酶和氧化终产物的改变。结果:HSYA对VSMC钙化抑制作用最明显的浓度为10^-6mol/L,遂将此浓度用于后续实验。茜素红染色显示:β-甘油磷酸诱导钙化模型成功,且羟基红花黄色素A能延缓β-甘油磷酸诱导钙化模型,减少钙化结节。Western印迹结果显示,HSYA组细胞钙化指标ALP、RUNX2、RANKL的表达量较HP组明显减少;α-SMA表达较HP组增加(均P<0.01)。HSYA组TLR4、TNF-α、IL-8和p-p65/p65的表达量较HP组减少,p65入核减少,细胞质内p65的表达增多(均P<0.05)。免疫荧光结果同时也显示β-甘油磷酸诱导能使P65入核增多,给予HSYA处理后,P65入核减少。在HSYA组中炎症相关指标IL-1β,IL-6的表达明显低于HP组,HP组炎症相关指标IL-1β,IL-6的表达明显高于对照组(p<0.01)。氧化应激试剂盒检测显示HSYA组细胞ROS和SOD含量较HP组明显升高,MDA含量较HP组明显降低(均P<0.01)。结论:1、HSYA可以延缓高磷诱导的血管平滑肌细胞的钙化。2、HSYA抑制了TLR4/NF-kB通路,抑制了炎症反应和氧化应激反应,延缓了高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化的过程。
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