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背景乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一,早期诊断和及时治疗是提高乳腺癌患者生存率的重要前提。相关研究已经证实,超声微泡不仅广泛用于乳腺癌的诊断,也可以作为药物的良好载体,在超声辐照下能释放药物,促进药物吸收从而促进肿瘤细胞的凋亡。由于传统超声微泡的粒径为微米级,是一种血池造影剂,同时缺乏靶向性,因此其不能穿过肿瘤新生血管识别肿瘤细胞上的特异性靶点,也不能携载治疗药物穿过肿瘤新生血管进入肿瘤组织内部,上述这些缺点限制了其在乳腺癌诊断和治疗方面的深入研究和临床应用。肿瘤新生血管内皮细胞之间存在间隙,粒径小于700nm的纳米级超声微泡即纳米泡原则上能穿过肿瘤新生血管的内皮细胞间隙。CXC型趋化因子受体4(CXCR4)在大多数实体肿瘤(包括乳腺癌细胞)的细胞膜上异常高表达,而在正常组织内低表达或不表达,已成为肿瘤特异性显像和靶向治疗中的一个高特异性靶点。CXCR4的配体为基质细胞衍生因子-1(SDF-1),SDF-1/CXCR4信号通路在肿瘤的生长、增殖、转移、侵袭过程中扮演重要角色,阻断这一信号通路能有效抑制肿瘤的生长,而AMD070是针对CXCR4的小分子拮抗剂,结构简单,易与脂质纳米泡相连接,使纳米泡具备靶向性。吲哚菁绿(ICG)作为临床广泛使用的荧光染料,是一种良好的光吸收材料,纳米泡携载ICG将同时具备超声、光声以及荧光多模态显像能力。目的构建携载AMD070的多模态显像纳米泡(ICG-TNBs);检测ICG-TNBs的体外多模态显像能力,研究ICG-TNBs靶向抑制CXCR4阳性表达乳腺癌细胞生长、促进凋亡的效果;同时进一步研究和探讨ICG-TNBs抑制乳腺癌细胞生长的作用机制,特别是ICG-TNBs对SDF-1/CXCR4信号通路活动的影响。材料与方法本课题分为三部分进行实验:1.ICG-TNBs的构建及其鉴定:(1)用碳二亚胺法和机械振荡法制备ICG-TNBs,测量其粒径、Zeta电位、ICG的携载量、包封率;观察ICG-TNBs形态;检测ICG-TNBs的荧光吸收特性;ICG-TNBs稳定性研究。(2)在体外琼脂糖模型上检测ICG-TNBs多模态显像能力。(3)用激光共聚焦显微镜观察ICG-TNBs与乳腺癌细胞的特异性结合能力、乳腺癌细胞对ICG-TNBs的特异性摄取能力。2.ICG-TNBs靶向抑制乳腺癌细胞的效果研究:(1)筛选超声辐照的理想参数,包括超声功率、辐照时间、纳米泡浓度。(2)研究ICG-TNBs对乳腺癌细胞的治疗浓度范围。(3)应用CCK-8和流式细胞术分别检测ICG-TNBs对乳腺癌细胞的生长抑制作用和促凋亡作用。3.ICG-TNBs靶向抑制乳腺癌细胞的机制研究:(1)扫描电镜观察ICG-TNBs在超声辐照下对乳腺癌细胞的空化效应。(2)检测ICG-TNBs对乳腺癌细胞内活性氧水平(reactive oxygen species,ROS)的影响。(3)蛋白印迹实验检测CXCR4、p-Akt/Akt、Caspase3及Cleaved-caspase3的表达情况。结果1.ICG-TNBs的构建及其鉴定:(1)ICG-TNBs的粒径和Zeta电位分别为(497.0±29.2)nm和(-8.05±0.73)mV,对ICG的携载量和包封率分别为(5.0±0.29)ug/mg和(80.2±0.64)%。ICG-TNBs在光镜和透射电镜下呈规则圆形。ICG在ICG-TNBs携载下荧光吸收特征未发生明显改变。ICG-TNBs具备良好的稳定性。(2)超声、光声、荧光信号强度随着ICG-TNBs浓度的降低而减低,ICG-TNBs具备良好的体外多模态显像能力。(3)ICG-TNBs与CXCR4阳性表达的MCF-7细胞能特异性结合并被其摄取进入细胞内部,而CXCR4阴性表达的MDA-MB-468细胞不能与ICG-TNBs结合或将其摄取。2.ICG-TNBs靶向抑制乳腺癌细胞的效果研究:(1)筛选出超声功率1.0 W/cm~2、辐照时间10 s、超声纳米泡浓度5×10~6-2×10~7个/mL为最佳超声辐照参数。(2)当ICG-TNBs的浓度达到5×10~6个/mL时,MCF-7细胞生长明显抑制,并随着浓度进一步增高而减弱,而对MDA-MB-468细胞生长无明显影响。(3)相比于PBS组和其他对照组,ICG-TNBs+US处理组对乳腺癌细胞的生长抑制作用和促凋亡作用最强。3.ICG-TNBs靶向抑制乳腺癌细胞的机制研究:(1)扫描电镜观察ICG-TNBs+US处理组中MCF-7细胞上的小孔和褶皱相较于对照组数量最多,说明ICG-TNBs+US的空化效应最明显。(2)ICG-TNBs+US处理组相较于其他对照组,其ROS水平最高,说明ICG-TNBs+US处理组促进ROS的产生。(3)WB实验结果显示,与对照组MDA-MB-468细胞相比,ICG-TNBs+US明显降低了MCF-7细胞的CXCR4表达量和Akt磷酸化水平(P<0.05),而其Caspase3及其剪接体表达量上升(P<0.05),表明ICG-TNBs+US能有效携载AMD070,并通过明显抑制SDF-1/CXCR4/Akt通路的活动抑制MCF-7细胞生长,空化效应和AMD070能有效提高MCF-7细胞内的ROS水平(P<0.05),进而提高Caspase3和Cleaved-caspase3的表达,诱导细胞凋亡。结论本研究成功构建了携载AMD070的超声、光声和荧光多模态显像纳米泡,并证实其不仅能特异性地与CXCR4阳性表达的乳腺癌细胞膜结合,还具有较好的靶向抑制乳腺癌细胞生长的作用。在此基础上,我们进一步深入探讨了其靶向抑制乳腺癌细胞生长的机制,即超声辐照下ICG-TNBs通过空化效应能有效提高肿瘤细胞的细胞膜通透性,促进AMD070有效抑制SDF-1/CXCR4/Akt通路的活动,提高细胞内ROS水平,促进Caspase3和Cleaved-caspase3的表达,导致肿瘤细胞生长抑制和凋亡。本研究不仅为靶向多模态诊疗一体化纳米泡的构建提供了新的思路,也为后续深入探讨携载AMD070的多模态显像纳米泡在体内靶向显像和抑制肿瘤生长的过程和机制奠定了详实的研究基础。