人类红细胞血型系统种类众多,其中Rh血型系统是最复杂的系统,也是最具多态性的血型系统。目前发现的Rh血型抗原已多达50种。临床上根据能否在红细胞膜表面检测到相应的RhD抗原,将Rh血型分为RhD阳性血型和RhD阴性血型两大类。其中RhD抗原是引起严重新生儿溶血病(hemolytic disease of newborn,HDN)的主要红细胞抗原,在输血医学和产科学中意义最为显著,是血型研究的重点。通过红细胞膜表面表达的D抗原数量和质量以及抗原性质的区别,现将RhD表型分为5种:正常D表型、弱D表型、增强D表型、表位不完全型D表型以及表位不完全型弱D表型。弱D表型红细胞膜表面的D抗原表达较弱,是D抗原的变异体的一种。日本学者Okubo等早在1984年通过吸收放散试验对经间接抗人球蛋白试验(indirect antiglobulin test,IAT)确认的RhD阴性样本进一步分析检测,显示其红细胞膜表面仍可检测到微量的RhD抗原,称之为D放散型(DEL型)。它属于弱D型的一种,抗原性极弱。目前,已发现至少17种DEL型等位基因,包括:RHD1227A,RHD(IVS3+1A),RHD885T,RHD(IVS5–38del4),RHD1252T,RHD(delEx8),RHD1222C,RHD(IVS1+1A),RHD3A,RHD(L18P),RHD(L84P),RHD(R10W),RHD(A137E),RHD-CE(4–9)-D,RHD-CE(2–5)-D,and RHD(1–9)-CE。中国人群DEL型个体已被证实携带有RHD1227A等位基因。与高加索人相比,DEL型在中国RhD阴性人群中比率较高,约占中国汉族RhD阴性人群的1/3。在临床输血中,我国一直以来对RhD阴性献血员只做弱D检测并未做DEL型检测,将DEL型血液视作RhD阴性血液用于RhD阴性患者的血液输注,在一定程度上可能会影响RhD阴性患者血液输注的安全性。同时,DEL型输血患者输注RhD阴性血液,也可能会在一定程度上造成RhD阴性血液资源的浪费。本课题以DEL型孕妇妊娠RhD阳性胎儿作为临床上DEL型受血者接受RhD阳性血液的模型,通过监测DEL型孕妇体内产生抗-D抗体产生情况及胎儿是否发生HDN来评估DEL型受血者接受RhD阳性血液的风险性。据此初步提出安徽地区汉族人群DEL型个体受血者的临床输血策略。从而在一定程度上节约RhD阴性血液资源,同时提高输血安全性。本研究选择DEL型献血者、接受DEL型血液的RhD阴性受血者、妊娠有RhD阳性胎儿的DEL型孕妇等作为研究对象,采用RHD基因序列分析、红细胞膜表面RhD抗原表位表达谱分析、抗-D效价测定及临床观察等方法,通过大样本量的实验数据和临床资料探讨安徽地区汉族人群DEL型的基因结构及其红细胞膜表面RhD抗原表位表达与抗-D同种免疫反应的相关性。通过观察接受DEL型血液的RhD真阴性受血者体内抗-D产生情况来评估RhD真阴性受血者是否可以安全地接受DEL型血液,即血液中心对RhD阴性血液是否有进一步进行DEL型检测的必要。目的:检测安徽地区汉族人群DEL型个体的基因结构,发现除1227A等位基因以外新的DEL等位基因。分析汉族人群中诱发或不诱发抗-D同种免疫反应的DEL型红细胞膜表面RhD抗原表位表达情况,分析安徽地区汉族人群是否存在部分DEL表型,为评价DEL型患者接受RhD阳性输血的可行性提供研究证据。初步提出安徽地区汉族人群DEL血型的临床输血策略,从而在一定程度上节约RhD阴性血液资源,提高输血安全性。方法:1.研究对象选择2008年1月~2017年1月在安徽省立医院、安徽医科大学第一附属医院就诊的RhD阴性的患者共计804例。包括515例RhD阴性的孕妇及21例输注了DEL型血液的真阴性受血者。孕妇的年龄在18~45岁。平均孕龄为28.1周且均为单胎妊娠。2.筛选DEL型个体将待检红细胞用生理盐水洗涤三遍后得到压积红细胞,取0.5~1 ml压积红细胞,加入1 ml三种不同来源的IgG、IgM混合单克隆抗-D血清,充分混匀,置37℃水浴箱吸收1 h,间断轻轻振摇试管3~5次,经PBS彻底洗涤至少6遍,通过IAT对最后一遍上清液行抗-D检测,结果为阴性后,于吸收后的压积红细胞中加入生理盐水并充分混匀,水浴箱中56℃,10 min放散,3 000 r/min,离心5 min,各取2滴放散液(100μl)与1滴(50μl)O型RhD阴性及1滴(100μl)O型RhD阳性红细胞进行IAT,判断DEL型个体。3.DEL型红细胞膜表面抗原表位表达谱分析采用微量吸收放散方法,通过与RhD抗原各种表位相对应的特异性单克隆抗体来检测DEL型红细胞表面RhD抗原表位(epD1~6和epD8~9)。分析汉族人群DEL型红细胞表面RhD抗原表位表达情况。4.免疫血液学方面的检测采用Auto Vue Innova全自动血型分析仪(微柱玻璃珠法)检测待检样本的ABO及RhD血型。RhC/c及RhE/e血型的检测采用试管法。将相应的抗-C,c,E,e试剂2滴加入有标记的试管中,每管中再加入1滴2~5%的待检红细胞悬液轻摇试管后,离心,判读并记录反应结果。DEL型孕妇产前抗体筛选及鉴定分别采用微柱玻璃珠抗人球蛋白法及试管法。用于抗体筛选及鉴定的谱细胞均采用上海血液中心的标准试剂红细胞。孕妇抗-D抗体效价检测采用经典的试管抗人球蛋白法,同时检测新生儿Hb及胆红素水平。5.RHD基因测序分析采用QIAamp Blood试剂盒从抗凝血中提取样本的基因组DNA,并调整到适当的DNA浓度。利用PCR-SSP法,设计针对RHD基因1~10个外显子的特异性引物,采用Roche Applied Science商业化试剂盒扩增所有DEL样本RHD基因1~10个外显子。PCR产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳后在紫外灯下检测结果。检测中以RhD阳性和阴性样本为样本对照,以人类β-actin基因为内对照。通过Oligo 4.0引物软件及DNA Club网络软件设计引物,依据美国生物信息中心(NCBI)中GenBank记录的人类血型RHD\CE基因,设计了10对内含子序列特异性引物,可特异性的扩增RHD变异基因的10个外显子及其侧翼序列,从而避开了被RHCE基因替换的外显子区域。PCR扩增产物使用ABI PRISM 3730全自动测序分析仪。通过PCR-SSP及DNA测序法鉴定RHD-CE-D杂交基因。结果:1.DEL个体RhCE表型分布804名盐水法初筛为RhD阴性的患者(包括515例RhD阴性孕妇)最终确认为DEL的221例,其中含142例DEL型孕妇,DEL在RhD阴性人群中的比例为27.5%,其中RhC阳性表型213例(占96.4%)。DEL个体的RHCE表型分布情况分别为:Ccee(81.00%)、CCee(10.86%)、CCEe(0.90%)、CcEe(3.62%)、ccEe(3.17%)、ccEE(0%)和ccee(0.45%)。2.DEL型孕妇的分子生物学特征共检测到DEL型孕妇142例。通过PCR-SSP及DNA测序发现130例(91.5%)DEL型孕妇携带RHD1227A等位基因。剩余的12例DEL型孕妇未检测到RHD1227A等位基因的存在。7例样本缺少RHD外显子4–9,4例样本缺少RHD外显子2–5,剩下的1例样本缺少RHD外显子4–7。通过Oligo 4.0引物软件及DNA Club网络软件设计引物,依据美国生物信息中心(NCBI)中GenBank记录的人类血型RHD\CE基因,并参照Legler及Wagner等设计的引物,设计了105.RHD基因测序分析对内含子序列特异性引物,可特异性的扩增RHD变异基因的10个外显子及其侧翼序列,从而避开了被RHCE基因替换的外显子区域,发现7例RHD-CE(4–9)-D,4例RHD-CE(2–5)-D以及1例RHD-CE(4–7)-D杂交基因。3.DEL型孕妇D抗原表达谱分析通过吸收放散技术采用16种已知针对不同红细胞膜表面D抗原表位的单克隆抗体对DEL型孕妇红细胞表面D抗原表位进行检测。结果发现不同的DEL等位基因编码不同的D抗原表达谱。可以将DEL型分为两种:部分DEL型及完全DEL型。130例携带RHD(K409K)等位基因的DEL型孕妇红细胞表面1~9表位检测均为阳性,即含有完整的红细胞D抗原表位;12例携带RHD-CE-D杂交基因的DEL型个体,缺少相应的D抗原表位,表现出部分D抗原表位特征。7例携带RHD-CE(4–9)-D等位基因的DEL孕妇缺少1.1,1.2,2.1,3.1,4.1,5.4,6.3,6.6以及8.1号D抗原表位;4例携带RHD-CE(2–5)-D等位基因的DEL孕妇缺少2.1,3.1,4.1,5.4,6.6,8.1以及8.2号D抗原表位;1例携带RHD(4–7)-CE等位基因的DEL孕妇缺少1.1,1.2,2.1,5.4,6.2,6.3,6.6以及8.1号D抗原表位。4.DEL型患者接受RhD阳性红细胞输血风险分析ABO以及RhD血型同型输注是我国临床输血的基本原则,目前,国内外对于DEL型患者输注RhD阳性血液后抗-D的产生情况以及输血反应的发生等风险性研究不多,本次研究通过分析妊娠RhD阳性胎儿的DEL型孕妇产生抗-D的频率和强度来模拟DEL血型患者输注RhD阳性血液的安全性,进一步探讨DEL患者接受RhD阳性输血的可行性和风险性。对来本院就诊的对142例DEL型孕妇体内抗-D抗体的表达水平进行监测,142例DEL型孕妇均为单胎妊娠共有6例DEL型孕妇体内监测到了抗-D,6例孕妇的抗-D效价在4到128之间,6例检测到抗-D的孕妇均无输血史,但均有妊娠史,且有生育史的孕妇怀有的子女均为RhD阳性。通过DNA测序发现,6例产生抗-D的DEL型孕妇均携带有RHD-CE-D杂交基因,且均存在一定程度的红细胞膜D抗原表位的缺失,通过吸收放散试验采用分别特异性地针对RhD抗原1~9表位(取消了第7表位)共16种单克隆抗体对6例DEL孕妇进行检测,结果显示,其红细胞膜表面均有不同程度的D抗原表位缺失。对6例孕妇进行随访发现,2例新生儿HDN结果为阳性,其中1例新生儿溶血症状较重,总胆红素值达到416 umol/L,抗-D效价为128。5.RhD真阴性患者患者接受DEL型红细胞输血的安全性分析对21例在本院及安徽医科大学第一附属医院接受DEL红细胞输血的RhD(-)DEL(-)(RhD真阴性)患者进行追踪和随访。21例中9例为反复输血。对21例患者输注DEL型血液前及输注后1周~6个月采用经典的抗人球蛋白法检测分别检测患者体内抗-D水平,均未见抗-D产生。该项结果提示,RhD真阴性患者接受DEL型红细胞输血应该是安全的,可能的原因是DEL红细胞膜表面D抗原密度太低不足以诱发有效的免疫应答。结论:1.安徽地区汉族人群DEL型存在基因多态性。2.DEL表型可以分为完全型DEL及部分型DEL,分别具有完整的及部分的D抗原表达谱。3.研究结果提示RhD真阴性患者接受DEL型红细胞输血是安全的,可能的原因是DEL红细胞膜表面D抗原密度太低不足以诱发有效的免疫应答。4.部分型DEL个体接受RhD阳性红细胞输血存在风险,因此,部分DEL患者接受输血治疗时应选择RhD阴性性红细胞。5.完全型DEL孕妇不需要接受产前免疫球蛋白预防;部分型DEL孕妇,因为缺少相应的D抗原表位,应接受产前免疫球蛋白的预防,避免胎儿及新生儿溶血疾病的发生。