目的:体质辨识是中医体质学研究的基础与核心,但中医体质辨识的标准化和客观化仍是一个有待解决的难题,限制了体质学说的应用和推广。从常规体检项目中挖掘判定体质的实验室指标,可辅助实现体质判定的客观化。既往研究表明,不同体质人群在免疫、代谢等功能方面存在差异。免疫组库技术是一个重大的开创性技术突破,本研究旨在将免疫组库测序技术应用于中医体质研究中,以期发现不同体质人群适应性免疫基因重排的不同表达模式和特异性标记。血浆蛋白质在机体的免疫和代谢过程中均发挥着至关重要的作用,免疫球蛋白约占血浆蛋白总量的20%,血浆蛋白质图谱的改变与中医体质的形成与发展关系密切,从血浆蛋白质中筛选出体质的血清生物标记物组合,对体质研究具有重要意义。方法:根据入组标准纳入9种体质健康受试者157例,进行常规体检,空腹采集外周静脉血及晨尿样本。1.收集性别、年龄、身高、体重、血常规、尿常规、生化全项等临床数据,并对血常规、尿常规、血生化分析等进行初步统计分析,对有统计学差异的变量进行多因素Logistic回归分析,计算各危险因素的判定价值。以OR值确定独立危险因素分值并建立预测模型,绘制受试者工作特征曲线,计算曲线下面积,评估其预测体质效能。2.选取8种体质共34名年龄匹配女性受试者,针对外周血T细胞受体(TCR)β链的的互补决定区(CDR3)片段进行高通量测序。分析不同体质人群TCR组库多样性差异及免疫图谱特征,包括多样性指数、CDR3长度分布、V区、J区基因亚家族使用频率和V-J组合的多样性、特异性CDR3序列,寻找高频CDR3氨基酸序列,基于V-J组合数据构建随机森林模型,绘制ROC曲线。3.以数据非依赖采集(DIA)技术进行血浆蛋白质组定量分析,筛选差异表达蛋白表并对其进行功能(GO功能注释)及富集通路(和KEGG富集通路富集分析),寻找血浆蛋白表达改变及其相关功能及通路与9种体质发生之间的关系,探究9种体质在蛋白质层面的调控机制及潜在的血清蛋白生物标志物。结果:1.与平和质组相比,偏颇体质健康人常规体检结果在正常范围内波动,其中阳虚质组身体质量指数(BMI)、中性粒细胞计数(NC)、碱性磷酸酶、尿酸、血浆白蛋白占比(ALB%)偏低,高密度胆固醇脂蛋白、载脂蛋白A1偏高;阴虚质血钙(CA)、血小板相对淋巴细胞比值(PLR)偏低,而NC、血钾(K)、血磷偏高;气虚质的乳酸脱氢酶(LDH)、α-羟丁酸脱氢酶(α-HBDH)偏低;气郁质的总胆固醇(TC)、载脂蛋白B偏低;痰湿质的体重、BMI、TC偏高;湿热质K、α-HBDH偏低;特禀质ALB%、LDH偏高,血小板计数、血小板比积、血清总蛋白、PLR、CA偏低,差异有统计学意义。对Logistic回归分析模型中的筛选的指标为检验变量绘制ROC曲线,计算曲线下面积(AUC),平和质组、阳虚质组、阴虚质组、气虚质组、气郁质组、痰湿质组、湿热质组、特禀质组的 AUC 值依次为:0.698、0.881、0.840、0.716、0.856、0.769、0.760、0.894。2.测序获得TCRCDR3特异克隆型2.86±1.63万种。分析免疫组库多样性,平和质组的 D50 指数、DI 指数、香农指数分别为:13.40±5.32、23.52±53.97、11.95±0.68,痰湿质组分别为:2.60±2.52、13.63±6.76、9.45±1.32,痰湿质组与平和质组相比D50值、DI指数、香农指数显著降低,其他各组与平和质组相比无显著差异。CDR3长度分布特征:一般由5-21个氨基酸组成的17种不同长度肽段序列构成,其中由9-15个氨基酸组成的7类多肽占总类的95%。健康人TCRβ链CDR3长度呈正态分布,不同体质CDR3长度分布存在差异。痰湿质组的短链CDR3占比增多,其中:9AA长度CDR3在痰湿质组平均占比(6.58±1.82)%,在平和质组平均占比(4.95±0.58)%,其他组平均占比(5.22±0.94)%;10AA长度CDR3在痰湿质组平均占比(13.35±2.85)%,平和质组平均占比(10.75±0.83)%,其他组平均占比(11.11±1.48)。痰湿质组长链CDR3占比减少,其中:13AA长度CDR3在痰湿质组平均占比(19.05±2.13)%,在平和质组平均占比(21.05±0.25)%,在其他组平均占比(20.69±1.28)%;14AA长度CDR3在痰湿质组平均占比(9.45±1.52)%,在平和质组平均占比(11.17±0.65)%,在其他组平均占比(10.91±1.10)%。其他各组无显著差异。与平和质组相比,7组偏颇体质者V基因片段使用频率存在差异,其中痰湿质组变化最显著。阳虚质组V7-8基因使用频率升高;阴虚质组无显著变化;气虚质组V6-3、V6-5、V6-6基因使用频率升高;V12-5基因使用频率下降,V4-1基因使用频率有下降趋势;气郁质组V11-2基因使用频率升高,V3-1、V4-1基因使用频率升高趋势;痰湿质组V9、V29-1、V30基因使用频率升高,V7-9、V10-3、V12-5、V20-1、V28基因使用频率下降,V2、V6-4基因使用频率有下降趋势;湿热质组V5-1、V18基因使用频率升高,V12-5、V28基因使用频率下降,V7-2使用频率有下降趋势;特禀质组V27、V28基因使用频率下降。与平和质组相比,7组偏颇体质者J基因片段使用频率存在差异。与平和质组相比,气虚质J1-4、J1-5、J1-6使用率下降;痰湿质组J2-1基因片段使用率升高。不同体质对不同J基因亚型使用率有不同的趋势。气郁质J1-1使用率有下降趋势,J2-3使用率有升高趋势;气虚质J2-5、J2-6使用率降低,J2-7使用率升高,气郁质与之有相反趋势。平和质组有享表位肽序列为ASSLSYEQY、ASSLTGNTEAF,未鉴定出偏颇体质明确独有的CDR3共有序列。与平和质组对比,应用随机森林(ROC)分类器对7种偏颇体质类型进行识别,计算ROC的曲线下面积:阳虚质组AUC:1,阴虚质组AUC:1,气虚质组AUC:0.778,气郁质组:0.772,痰湿质组:0.833,湿热质组0.944,特禀质组0.444。3.血浆蛋白质组学结果显示:与平和质组相比,阳虚质差异表达蛋白(differentially expressed proteins,DEPs)共 16 个(上调 6 个,下调 10 个),Keratin,type Ⅱ cytoskeletal 2 epidermal、Transgelin-2、Talin-1等3个蛋白仅在阳虚质组差异表达,阴虚质组共201个DEPs(上调 70 个,下调 131 个),IGKV4-1、HSPA8、NCAM1、ANPEP、ORM2、OGN、FLT4、SH3BGRL3、PROCR等10个蛋白仅在阴虚质组差异表达,气虚质DEPs共195个(上调70个,下调125个),IGLV2-8、MMP2、LGALS3BP等3个蛋白仅在气虚质组差异表达,气郁质DEPs共11个(上调3个,下调9个),ATP2A1、HIST1H2BK、APCS、MYH7等4个蛋白仅在气郁质组差异表达,痰湿质组DEPs共171个(上调65个,下调106个),TXN、PZP、COLEC11等3个蛋白仅在痰湿质组差异表达,湿热质组 DEPs 共 185 个(上调 65 个,下调 120 个),S100A9、KRT10、CRTAC1、FCGBP 等4个蛋白仅在湿热质组差异表达,血瘀质组共检测到显著性差异蛋白(DEPs)185个(上调66个,下调119个),B2M、IL1RAP蛋白仅在血瘀质组差异表达,特禀质组DEPs共168个(上调65个,下调103个),LCAT、PON1蛋白仅在特禀质组差异表达。KEGG分析表明,补体和凝血级联、NF-κB信号通路等免疫相关信号通路、自身免疫性甲状腺疾病、糖胺维生素结合蛋白、磷脂酶D信号通路、cGMP-PKG信号通路等免疫及代谢信号通路是8种体质共有显著变化的信号通路。阳虚质组以甲状腺激素信号通路、雌激素信号通路、扩张型心肌病、肥厚型心肌病、心律失常与动脉粥样硬化等信号通路的显著性富集为其与其他体质区分的关键机制等。结论:常规体检项目有潜力用于客观判别体质类型。不同体质人群免疫功能存在差异。痰湿体质的免疫组库多样性下降,CDR3长度分布有倾斜。免疫组库测序技术可以区分体质类型,尚未发现不同体质人群的特异性CDR3,不同体质人群免疫组库差异可能表现在V-J组合丰度上。偏颇体质的血浆蛋白表达存在改变。补体和凝血级联信号通路、B细胞受体信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、NF-κB信号通路等免疫相关信号通路中 C9、IGHG3、AQR、SOD1、TF、CD44、APOL1、APOC2、TUBB1 蛋白表达的改变可能是8种偏颇体质所共有的变化,提示偏颇体质均有以补体和凝血级联为代表的免疫机能的降低。Transgelin-2、HSPA8、ATP2A1、TXN、S100A9分别是阳虚质、阴虚质、气郁质、痰湿质、湿热质的潜在分子标记。客观判定体质类型可能需要从多个维度分析,需要使用一组生物标记物共同构建判别模型。