目的:小肠是人体中重要的消化和吸收器官。肠上皮由单层柱状上皮细胞通过紧密连接组成，机体通过肠黏膜上皮机械屏障、免疫屏障和肠道菌群屏障，可有效阻止病原菌和毒素越过肠黏膜屏障侵入肠道以外的组织和器官，从而保证机体处于健康状态。肠道分泌型细胞主要包括杯状细胞和潘氏细胞，对于维持肠上皮正常屏障功能具有十分重要的作用。杯状细胞分泌形成的黏液层能够减少上皮细胞与病原菌的接触，潘氏细胞分泌的抗菌肽也有助于清除病原菌。
　　小肠上皮由隐窝-绒毛结构单元组成。具有自我更新和分化潜能的小肠干细胞(ISC)位于隐窝底部，其分裂产生的过渡扩增细胞可持续分裂并沿“隐窝-绒毛”轴向上或向下迁移，分化形成吸收型和分泌型肠上皮细胞。肠上皮干细胞/前体细胞向分泌型还是吸收型细胞分化的命运主要由Notch信号通路决定。研究已经表明生物节律可调节潘氏细胞节律性表达WNT信号分子，从而影响干细胞和前体细胞的细胞周期。推测肠上皮干细胞和前体细胞的分化可能受生物节律调节。本课题通过研究生物节律对肠上皮分泌型细胞分化的影响，进一步探讨生物节律基因突变或生物钟紊乱和肠上皮稳态及肠道屏障功能之间的联系。
　　方法:1、建立生物钟基因Bmal1全身敲除（Bmal1-/-）和肠上皮特异性敲除Bmal1(Bmal1△IEC)的小鼠模型及生物钟诱导紊乱模型。
　　2、小鼠模型经过12L∶12D光线牵引一周后，12L∶12D条件下取样，从光照开始时间记为ZT0，每隔4个小时分别取空肠、回肠、近端结肠和远端结肠，ZT0到ZT24共取7个时间点，4％福尔马林固定后，进组织包埋、H&E和免疫组化标记分泌型细胞类型，统计各细胞类型的数量。取小肠和结肠整段液氮冻存，提取mRNA逆转录，qPCR检测各细胞类型标记分子表达及信号通路分子表达变化。收取肠上皮细胞进行免疫印迹，检测生物节律蛋白和分化信号的表达。
　　3、结合位点预测软件分析目的基因结合位点，ChIP和双报告基因实验验证MAL1/CLOCK蛋白复合体和Atoh1的结合与转录调节作用。
　　4、Bmal1△IEC小鼠链霉素处理后喂食鼠伤寒杆菌，建立伤寒杆菌感染模型，记录体重和临床打分，取空肠、近端结肠，4％福尔马林固定后进行组织包埋、H&E染色观察肠道病理情况。
　　结果:研究发现Bmal1-/-小鼠的肠上皮细胞，其时钟基因表达不呈现昼夜节律变化。Bmal1-/-和Bmal1△IEC小鼠肠上皮中，分泌型细胞包括杯状细胞、潘氏细胞和肠内分泌细胞的数量明显减少。在采用光照牵引建立的生物钟紊乱小鼠模型中，也观察到一致的表型。决定肠上皮分泌型细胞分化的重要转录因子Atoh1表达显著下降，而Notch信号受到抑制。因此生物钟基因缺失导致的Atoh1的转录抑制不依赖于Notch信号通路。推测Bmal1可能通过调节Atoh1的表达，在肠上皮干细胞向分泌型细胞的分化过程中起了重要作用。ChIP和luciferase实验证实了BMAL1/CLOCK蛋白复合体对Atoh1的转录具有促进作用。用鼠伤寒杆菌口服感染时，Bmal1△IEC小鼠较野生型小鼠体重下降更快，死亡率更高，表明生物钟基因缺失导致的分泌型细胞数量的减少降低了肠道对病原菌的抵抗力。
　　结论:生物钟基因Bmal1通过调控分泌型细胞关键转录激活因子Atoh1调控肠上皮干细胞分化方向和分化时间。Bmal1敲除或生物节律紊乱都会导致肠上皮分泌型细胞数量减少，影响肠上皮黏膜屏障功能，减弱肠道抵抗病原入侵的能力。