雌激素在人体内的作用广泛,在人体的多个系统都发挥着重要的生理功能。植物雌激素是主要来源于植物,可以起到类似雌激素作用的活性成分。许多中药方剂长期应用于妇科临床并具有显著疗效,针对其药理机制的研究发现,在人体的多个系统都发挥着重要的生理功能。四物汤被誉为“妇科第一方”,由当归、川芎、白芍、熟地黄四味药组成,应用于妇科的功效主要为补血调经。前期已经有研究表明四物汤可以发挥拟雌激素样作用或抗雌激素样作用,本篇研究将从四物汤的植物雌激素效应入手,两个方面探讨四物汤植物雌激素效应的双向调节。一方面,本研究用乳腺癌细胞来探究四物汤的抗雌激素样效应的分子机理,应用网络药理学、分子对接等方式筛选出四物汤对非三阴性乳腺癌的关键靶点,然后用乳腺癌（MCF-7）细胞进行体外验证。另一方面,本研究用雌性SD大鼠来探究四物汤的拟雌激素效应的分子机理,应用网络药理学结合文献研究查找分析“四物汤-雌激素”的关键通路靶点,并进行了体内实验的验证。本文的具体研究内容以及结果如下:（1）四物汤成分靶点数据库的建立从TCMSP数据库中收集四物汤的有效入血成分,熟地黄有效成分2种,白芍有效成分13种,川芎有效成分7种,当归有效成分2种。从ETCM数据库中收集到符合标准的四物汤主要成分共121种,其中白芍的有效成分16种,川芎的有效成分53种,当归的有效成分51种,熟地黄的有效成分有1种。接着,从TCMSP数据库收集每一成分的靶点信息。同时使用SwissTarget数据库寻找与成分化学结构相匹配的靶点。整合两个数据库的靶点作为药物靶点数据进行使用。（2）非三阴性乳腺癌相关靶点收集从OMIM,GeneCards收集乳腺癌的相关靶点,同时从GEO数据库中筛选相关的芯片进行差异分析,进行整合。共筛选出3131个non-TNBC相关基因。（3）“四物汤-非三阴性乳腺癌”关键|靶点的筛选整合“四物汤-非三阴性乳腺癌”数据靶点,获得相关基因79个,构建蛋白互作网络,“degree”值前十的靶点为:IL6,AKT1,JUN,PTGS2,MAPK8,CASP3,ESR1,CAT,MMP9 和 PPARG。通过 oncomine 肿瘤数据库以及 Kaplan-Meier 生存分析网站进一步筛选,将PTGS2,ESR1,CAT,PPARG确认为关键靶点进行后续验证。（4）“四物汤-非三阴性乳腺癌”关键靶点的分子对接验证四物汤的化学成分与靶点的结合度良好,其中Myricanone与PPARG的对接分数为-8.8,（+）-catechin 与 CAT 的对接分数为-7.8,Beta-sitosterol 与 PTGS2 的对接分数为-9.2,（+）-catechin与ESR1的对接分数为-8.0。（5）四物汤对MCF-7细胞抗雌激素样作用靶点验证四物汤干预后,MCF-7细胞增殖明显减少,四物汤浓度在5mg/mL的浓度时抑制效果最好。RT-PCR检测结果表明:与对照组相比,四物汤组的PTGS2,ESR1,PPARG的mRNA表达量水平升高（P＜0.01）。与对照组相比,四物汤组CAT的mRNA表达水平降低。Western Blot结果与RT-PCR结果一致。因此,四物汤可以通过调控PTGS2,ESR1,PPARG,CAT等靶向位点对MCF-7细胞发挥抗雌激素样作用。（6）“四物汤-雌激素”相关通路机制分析依据“四物汤-雌激素”相关靶点,KEGG通路分析符合p-value＜0.05的共有132 条通路。与激素相关的通路有:AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Prolactin signaling pathway、Endocrine resistance、Estrogen signaling pathway、MAPK signaling pathway;炎症相关的通路有:TNF signaling pathway、NF-kappa B signaling pathway、IL-17 signaling pathway、C-type lectin receptor signaling pathway、Th17 cell differentiation、Hepatitis C;免疫相关的通路有:Toll-likereceptor signaling pathway、C-type lectin receptor signaling pathway;有关凋亡的通路有:Platinum drug resistance、Apoptosis、Apoptosis-multiple species;神经系统相关通路:Neurotrophin signaling pathway;代谢相关的通路有:Tryptophan metabolism、Drugmetabolism-cytochrome P450。根据相关文献以及前期研究基础,本研究将重点探究雌激素信号转导通路以及MAPK信号转导通路。（7）四物汤对雌性SD大鼠卵巢、子宫组织雌激素信号通路的影响卵巢组织的WB结果显示四物汤组ERα,ERβ与正常组相比明显增多,与雌二醇组的结果一致,并且具有剂量依赖性。然而四物汤组GPER低于正常组,具有剂量依赖性。卵巢免疫组织化学结果显示,ERα,ERβ,GPER在各级卵泡中的表达较为明显,其中GPER主要分布于细胞膜上,ERα,ERβ主要分布在细胞核上。RT-PCR的结果显示,四物汤组ERα,ERβ的mRNA水平与正常组相比下降,然而GPER的mRNA水平比正常组升高。WB与mRNA测定表达水平不同,提示我们四物汤对雌激素受体的调控很有可能是在转录后。结果表明,四物汤对卵巢组织发挥作用时,对不同雌激素受体的调控情况不同,对GPER的调控效应更为明显。子宫组织的WB结果显四物汤组ERα,ERβ与正常组相比明显增多,与雌二醇组的结果一致,并且具有剂量依赖性。四物汤高剂量组GPER低于正常组,四物汤低剂量组的GPER高于正常组,不具有剂量依赖性。说明四物汤的不同剂量对GPER的表达调控效应不同。免疫组织化学的结果表明四物汤高剂量组ERα,ERβ,GPER在子宫中的表达量与阳性对照组趋势一致,且高于正常组。与WB结果趋势一致。RT-PCR的结果显示,子宫ERβ的mRNA水平较低,ERαmRNA水平较高。四物汤组与正常组相比ERα、GPER的mRNA水平均降低,四物汤组ERαmRNA水平高于GPER。可以看出,四物汤对子宫发挥拟雌激素样作用时,通过调控ERα,GPER的效应更为明显。（8）四物汤对SD幼鼠卵巢、子宫组织MAPK信号通路的影响对卵巢以及子宫组织测定的WB与RT-PCR的结果显示:EGFR的表达量与四物汤剂量的高低密切相关,不同剂量的四物汤对EGFR的效应不同;WB与mRNA表达结果的不同,表明了四物汤的作用极有可能是在转录后调控;四物汤可以通过雌激素受体介导的EGFR途径对卵巢组织发挥拟雌激素样效应。MAPK通路的下游靶标,即MAPKp38,ERK1+2,MEK1+2都有所下降,表明四物汤在发挥植物雌激素效应时需要下调MAPK通路的下游靶标来发挥作用。ERK1+2与细胞的增殖和抗凋亡密切相关,四物汤调控了这条路径的表达,说明四物汤在卵巢、子宫组织发挥雌激素样作用时可能与细胞的增殖、凋亡反应关系密切,也是课题组后续研究和探讨的方向之一。综上所述,为研究四物汤雌激素样效应的双向调节作用机制,本篇研究从体内、体外,生理、病理,虚拟筛选、实验论证等多个方面评估探究了四物汤的药效及其分子机理。一方面,本篇研究应用MCF-7细胞探究四物汤发挥抗雌激素样作用的多靶点分子机制。结果表明,四物汤可以对MCF-7细胞发挥抗雌激素样作用,并且其机制与调控PTGS2,ESR1,CAT,PPARG等靶点相关。另一方面,本篇研究应用SD幼鼠来探究四物汤发挥拟雌激素样作用的分子机理。结果表明,四物汤对SD幼鼠的子宫、卵巢组织具有拟雌激素样作用,并且通过调控雌激素信号通路、MAPK信号通路来发挥作用。