醋酸菌(Aceticacidbacteria,AAB)是一类革兰氏阴性菌,在有氧条件下,能氧化乙醇、糖或糖醇等生成相应有机酸。截止2016年初,AAB包括醋杆菌属(Acetobaacter)、酸单孢菌属(Acidomonas)、雨山杆菌属(Ameyamaea)、朝井杆菌属(Asazia)、熊蜂属(Bombella)、葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、颗粒杆菌属(Granulibacter)、驹形杆菌属(Komagataeibacter)、公崎杆菌属(Kozakia)、新朝井杆菌属(Neoasaia)、新驹形杆菌属(Neokomagataea)、阮杆菌属(Nguyenibacter)、糖杆菌属(Saccharibacter)、斯瓦米纳坦杆菌属(Swaminathania)、斯温斯杆菌属(Swingsia)和塔堤查仁杆菌属(Tanticharoenia),共17个属,85个种。AAB广泛用于生产醋酸、纤维素、吲哚乙酸、表面活性剂和色素,极个别AAB还是病原菌,但酿醋可能是AAB的主要用途。其中,醋杆菌属和驹形杆菌属的AAB是食醋酿造中最常用的。前者主要用于东方谷物醋的酿造,后者主要用于欧美国家果醋的酿造。巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus,Ap)CICC 20001(又名沪酿1.01)和CGMCC 1.41(又名AS1.41)可能是我国最早分离得到的AAB,目前仍广泛用于我国食醋的酿造,具有很好的产酸耐酸能力和遗传稳定性。在食醋工业中,如何提高AAB产酸耐酸能力,并维持其遗传稳定性是非常重要的两个问题。目前,一般认为AAB的产酸耐酸与醋酸的同化和转运、细胞膜成分和应激蛋白等相关。但大肠杆菌和乳酸菌等的耐酸研究表明,氯离子通道、精氨酸和谷氨酸代谢等也与微生物耐酸相关。另外,在AAB产酸耐酸遗传稳定性方面,关于驹形杆菌的研究结果认可度较高,而关于醋杆菌的存在较大争议。本研究首先研究了不同发酵条件对巴氏醋杆菌CICC 20001和CGMCC 1.41产酸的影响,然后采用PacBio三代测序技术对这两株菌进行了全基因组测序;并采用比较基因组学方法,对巴氏醋杆菌产酸耐酸机制以及遗传稳定性进行了分析;最后,就DNA碱基甲基化对AAB产酸耐酸的调控作用进行了探讨。1发酵条件对巴氏醋杆菌CICC 20001和CGMCC 1.41产酸的影响大量研究表明,添加一定的发酵起始酸对AAB产醋酸有明显促进作用。为此,在摇床液态发酵(GYP培养基,250mL三角瓶装样100 mL,170 r/min,30℃,乙醇浓度为6%)条件下,研究了添加不同种类与浓度的发酵起始酸对CICC 20001和CGMCC 1.41产醋酸的影响。结果表明,分别添加1%和0.5%的起始醋酸时,有利于它们产生醋酸,当起始醋酸超过1.5%和3.5%时,则能明显抑制它们产生醋酸;而添加1%和0.5%其它起始有机酸(包括琥珀酸、柠檬酸、草酸、苹果酸和乳酸)时,促进效果远不及同等浓度的醋酸,且相同浓度的草酸、苹果酸和乳酸能明显抑制它们产生醋酸。用HC1调pH值至3.86和3.54(等同于添加0.5%和1%醋酸的pH值)时,对CICC 20001和CGMCC 1.41醋酸的产生有明显抑制作用。这说明,添加醋酸对醋酸发酵的促进作用源于醋酸本身,而非对发酵液pH值的调节。进一步分析发现,不添加醋酸时,CICC 20001和CGMCC 1.41的乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase,ADH)和乙醛脱氢酶(Aldehyde dehydrogenase,ALDH)均为0.3 U/mL左右,而添加醋酸(分别为1%和0.5%)时,两菌株ADH和ALDH酶活均增加15%-20%。这表明,起始酸对产醋酸的影响可能是通过提高ADH和ALDH酶活实现的。在相同起始醋酸浓度(分别为1%和0.5%)下,研究了起始乙醇浓度对CICC 20001和CGMCC 1.41产醋酸的影响。结果表明,当乙醇分别为6%和8%时,最有利于两菌株产生醋酸,此时醋酸终浓度分别达到6.25 g/100mL和6.75 g/100mL,而乙醇浓度超过6%和8%时,两菌株的适应期延长,醋酸终浓度不增加,乙醇转化率下降。在相同起始醋酸(分别为1%和0.5%)和乙醇(分别为6%和8%)浓度下,添加0.5%精氨酸可增加CICC 20001和CGMCC 1.41醋酸的生产,增幅达2.1%-3.3%;添加1 mmol/LMg2+和K+也可提高醋酸产量,而同浓度的Fe3+和Zn2+则抑制醋酸产生;250 mL三角瓶中培养基装样量为50 mL时,两菌株醋酸的产量分别达到6.8 g/100mL和7.35g/100mL,此时,ADH酶活最高,分别达0.42U/mL和0.38U/mL。综上所述,起始醋酸对CICC 20001和CGMCC 1.41产醋酸的促进作用源于醋酸本身,而非对pH值的调节作用;两菌株产醋酸的最高起始乙醇浓度分别为6%和8%;1 mmol/LMg2+和K+可促进醋酸生产,而同浓度Fe3+和Zn2+则抑制醋酸产生;添加0.5%精氨酸也可促进醋酸的产生;250 mL三角瓶中装样量为50 mL时有利于醋酸的产生。2巴氏醋杆菌基因组特性及耐酸机制分析采用PacBio三代测序技术对CICC 20001和CGMCC 1.41的基因组进行了测序、组装和注释。两株菌各拼接成一条完整的细菌染色体和若干质粒(分别为10个和7个)。它们的基因组大小分别为2865612 bp和2928931 bp,G+C%分别是52.94%和52.95%,编码序列分别为3006条和3012条。与9株以前已完成基因组测序并公布序列的巴氏醋酸菌比较分析发现,巴氏醋杆菌的染色体具有很高同源性,但不同菌株的质粒DNA存在较大差异。这表明,它们的染色体比较保守,且可能和质粒DNA是分开进化的。分析还表明,巴氏醋杆菌的氨基酸组成非常相似,都含较多的丙氨酸、亮氨酸和甘氨酸。在耐酸机制方面,比较基因组分析发现,基因组中膜结合乙醇脱氢酶的拷贝数与巴氏醋杆菌的产酸耐酸能力成正相关;CICC20001和CGMCC 1.41的基因组中包括已报道的参与AAB产酸耐酸的醋酸同化与转运、应激反应等所有相关基因。另外,像大肠杆菌一样,环丙烷脂肪酸可能也参与巴氏醋杆菌产酸耐酸;苏氨酸、天冬酰胺和鸟氨酸降解产生的NH3可能也参与了巴氏醋杆菌的产酸耐酸。总之,通过基因组测序与比较分析发现,巴氏醋杆菌的基因组大小、组成等基本相似,染色体比较保守,但质粒DNA差异较大;CICC20001和CGMCC 1.41基因组中包含了已报道的参与AAB产酸耐酸的所有相关基因。此外,环丙烷脂肪酸以及苏氨酸、甘氨酸和鸟氨酸的代谢也可能与巴氏醋杆菌的产酸耐酸。3基于比较基因组学解析巴氏醋杆菌的遗传稳定性差异目前,关于巴氏醋杆菌产酸耐酸等遗传稳定性存在较大争议。为此,对遗传稳定较差的8株巴氏醋杆菌IFO 3283亚株,以及遗传稳定性较好的CICC 20001、CGMCC 1.41和386B基因组中稳定与不稳定因子进行了比较分析。结果表明,对于导致基因组遗传不稳定的插入序列、基因岛、前噬菌体及质粒等主要因子,IFO 3283亚株均含有156个,386B、CICC 20001和CGMCC 1.41分别为101、117和148个;对于维持基因组稳定的限制修饰系统和毒素抗毒素系统等主要因子,IFO 3283各亚株共含有5-6个,而386B、CICC 20001和CGMCC 1.41分别为4、8和9个。以上分析表明,与遗传不稳定的IFO 3283各亚株基因组相比,遗传稳定的386B基因组中稳定因子和不稳定因子均较少,而CICC 20001和CGMCC 1.41的基因组中不稳定因子少而稳定因子多,因此,巴氏醋杆菌产酸耐酸等遗传稳定性的差异可能与它们基因组中遗传稳定性和不稳定性因子的组成和数量有关。4 DNA甲基化对AAB产酸耐酸影响的初探选取病毒、古菌、细菌和真核微生物的基因组,共200个,分别对它们基因组中m6A、m4C和m5C的甲基化酶构建系统进化树。分析发现,m6A甲基化酶存在于绝大多数古菌和细菌以及个别真核微生物基因组中;m4C甲基化酶在古菌、细菌和真核微生物基因组中分布都较为广泛;而m5C甲基化酶则存在于绝大多数真核微生物和少量细菌的基因组中;病毒的基因组中未发现DNA甲基化酶。进一步分析发现,24株已完成测序并公布了序列的AAB基因组中共含有61个m6A、62个m4C和5个m5C甲基化酶基因。每株AAB至少含有1个m6A和m4C甲基化酶基因,可见它们是AAB基因组中主要的甲基化酶。巴氏醋杆菌CICC 20001含有6个m6A,6个m4C和1个m5C甲基化酶基因;而CGMCC 1.41含有6个m6A,3个m4C和1个m5C甲基化酶基因。这些m6A甲基化酶属于γ型-“motifⅩ-Ⅰ-Ⅱ-Ⅳ-Ⅵ-Ⅶ-Ⅷ-TRD”,即目标识别区域位于两端,而m4C甲基化酶则属于β型-”motif Ⅳ-Ⅴ-Ⅵ-Ⅶ-Ⅷ-TRD-Ⅹ-Ⅰ-Ⅱ-Ⅲ",即目标识别区域在中间位置。另外,在24 株 AAB 基因组中,只有Ap CICC 20001,Ap CGMCC 1.41,Gluconobacter oxydans 621H,Gluconacetobacter diazotrophicus PAI 5和Komagataeibacter xylinus E25,共 5株菌的基因组中,含有与很多基因的沉默有关的DNMT1型m5C。基于三代测序所得到的DNA甲基化数据,探讨了 DNA甲基化模体(Motif)在巴氏醋杆菌CICC 20001和CGMCC 1.41染色体上的分布。分析发现,CICC 20001和CGMCC 1.41都含有参与细胞分化的DNA甲基化模体“GANTC”和功能未知的“GTAC”。此外,CICC 20001还含有未见报道的甲基化模体“AACGAG”和“TGGCCA”。将这些模体与产酸耐酸的相关基因相配对分析发现,在CICC 20001基因组中,95%以上的产酸耐酸相关基因上都含有“GTAC”和“GANTC”甲基化模体,且通常位于基因上游位置;而在CGMCC 1.41基因组中,96%以上的产酸耐酸相关基因上都含有“GTAC”甲基化模体,少数基因含有“GANTC”模体。此外,其它甲基化模体在产酸耐酸相关基因上分布也较为广泛。这表明,DNA甲基化酶很可能参与醋酸菌的产酸耐酸过程。