论文部分内容阅读
小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)治疗肿瘤具有明显的疗效，大大改善了患者的存活率。这些激酶抑制剂的靶点是ATP绑定口袋(ATP binding pockets)，通过阻碍ATP和激酶的结合，从而抑制激酶下游信号通路的磷酸化。然而部分TKIs具有显著的心脏毒性，主要表现为左室收缩功能障碍，严重者可引发心衰。目前为止，在美国临床应用的30个TKIs中，有26个在说明书中标有心脏毒性黑框警告。苏尼替尼(sunitinib，SNT)是多靶点的TKI，临床资料显示应用SNT可引发28%病人出现心脏收缩功能障碍，其中8%导致心衰。另一个回顾性研究发现，SNT会导致15%的病人出现3或4级心衰。2016年欧洲心脏委员会(ESC，European Society of Cardiology)发表的肿瘤治疗心脏毒性指南称SNT导致高达19%患者出现左室功能障碍。由于TKIs引发心脏收缩功能障碍确切的分子机制了解有限，目前尚无特异防治策略。
心肌细胞的兴奋-收缩耦联是心肌收缩功能的关键环节。心肌细胞膜去极化后，Ca2+通过激活的电压依赖型L型钙通道(LTCC，Cav1.2)进入细胞。钙诱导钙释放作用(Ca2+-inducedCa2+release，CICR)使Ca2+通过雷诺丁受体(ryanodine receptors，RyR2)从肌浆网(sarcoplasmic reticulum， SR)释放到胞浆，Ca2+瞬变达到峰值，Ca2+与肌钙蛋白C结合，心肌收缩。心肌舒张需要游离Ca2+浓度降低，使Ca2+与肌钙蛋白分离，主要通过四个途径将Ca2+从胞浆中转运，包括肌浆网Ca2+-ATPase(SERCA)，细胞膜Na+/Ca2+交换(NCX)，细胞膜Ca2+-ATPase或线粒体Ca2+单向转运。受磷蛋白(Phospholamban，PLB)是SERCA的内源性抑制剂，环磷酸腺苷依赖的蛋白激酶或者钙调蛋白(PKA/CaMKII)能够磷酸化PLB，解除其对SERCA的抑制作用，加快钙回摄，增强心肌收缩力。
有研究发现，SNT可浓度依赖性降低钙瞬变、从而减弱心房组织的肌张力。离体细胞实验发现，伊马替尼(Imatinib，是一个与SNT类似的多靶点TKI药物)会显著性激活新生大鼠心肌细胞(NRVMs)的CaMKII活性，导致钙调控异常，引发心肌毒性。索拉非尼(Sorafenib，另一个多靶点TKI药物)急性作用会导致心肌细胞SR钙储备降低33%、钙瞬变降低50%，从而减小细胞收缩力。上述结果提示心肌肌浆网钙储备减少导致钙瞬变幅度降低是SNT导致收缩障碍的原因。那么其分子机制是什么？
近几年人们试图寻找TKIs的直接作用靶点和心脏毒性之间的关系，结果并未发现引发心脏毒性的特异性TK。TKIs可能是通过抑制TK下游的信号通路(靶向作用)或者TK以外的其他激酶(脱靶作用)，导致心脏收缩功能障碍。前期实验结果表明TKI造成心肌毒性时伴随细胞内激酶信号通路活性的改变，主要包括AMPK、CaMKII、PKA和PI3K。SNT可显著抑制AMP激活的蛋白激酶(AMPK)。Imatinib和SNT急性作用导致豚鼠心肌CaMKIIδ活性和表达增高。SNT会导致PKA活性降低，引发心肌线粒体损伤、心肌纤维化和心脏功能障碍。另外，Dasatinib、Sunitinib和Nilotinib会抑制心肌细胞PI3K活性和表达。已知CAMKII、AMPK、PKA以及PI3K等激酶均可直接或间接影响心肌细胞钙稳态，因此我们设想，干预上述激酶活性可能预防TKI引发的心脏收缩功能紊乱。
为验证上述假设，本研究首先在人诱导干细胞分化的心肌细胞(hiPSC-CMs)上采用激酶的药理学抑制剂或激动剂找出保护SNT引发心脏收缩功能障碍最有效的干预通路，然后在动物水平进一步验证其对SNT引发钙调控紊乱-收缩功能障碍的作用。为临床防治SNT造成的心室收缩障碍提供新的思路。
第一部分干预激酶活性对SNT引发hiPSC-CMs收缩紊乱的影响
目的：寻找保护SNT导致hiPSC-CMs收缩抑制和钙调控紊乱的激酶靶点。
方法：
1.免疫荧光观察心肌细胞标志物，验证hiPSC-CMs的纯度。
2.利用CardioExcyte96心肌细胞实时监测系统，观察SNT对hiPSC-CMs收缩的影响。激光共聚焦系统观察SNT对hiPSC-CMs钙瞬变的影响。观察以下激酶激动剂或抑制剂：PKA抑制剂H89，CaMKII抑制剂KN-93，AMPK激动剂Metformin和AICAR，PI3K活性物质PI(3,4,5)P3对细胞收缩的影响。
3.进一步观察(腺病毒中介)过表达细胞PI3K(p110α)，对SNT引发钙瞬变、细胞收缩紊乱的影响。
结果：
1.hiPSC-CMs复苏、培养7天后，免疫荧光实验发现心肌特异标志物α-Actin和TNNT2可以显著表达，心肌细胞纯度达到90%以上。
2.SNT(0.5~20?M)在72小时内呈浓度依赖性和时间依赖性抑制hiPSC-CMs收缩，72小时测得IC50为2.142?M。SNT2?M减小钙瞬变幅度(F/F0)(2.25±0.11vs1.84±0.07,P＜0.05)和频率(bpm)((29.95±1.29vs22.89±1.29，P＜0.01)，延长钙瞬变达峰时间(ms)(355.80±23.47vs481.9±31.21，P＜0.05)和钙回收时程(ms)((1298.00±77.20vs2438.00±217.31，P＜0.01)。SNT给药前4小时孵育PIP3(1?M)以激活PI3K，能够明显减轻SNT引发的钙瞬变幅度(F/F0)(2.31±0.13vs1.84±0.07，P＜0.05)和频率(bpm)((30.67±0.74vs22.89±1.29，P＜0.01)降低，以及钙瞬变达峰时间(ms)(362.00±14.18vs481.9±31.21，P＜0.05)和回收时程(ms)(1369.00±56.98vs2438.00±217.31，P＜0.01)延长，并且显著预防SNT对收缩(0.49±0.04vs1.07±0.13，P＜0.05)的抑制。而SNT给药4小时前孵育CAMKII选择性抑制剂KN-93(50 nM)、PKA抑制剂H89(1?M)以及AMPK激活剂二甲双胍(2 mM)和AICAR(2 mM)对SNT导致hiPSC-CMs收缩抑制无明显影响(P＞0.05)。
3.SNT给药48小时前腺病毒感染过表达PI3K(p110α)，结果发现与药理学手段激活PI3K一样，过表达p110α能够显著预防SNT导致hiPSC-CMs钙调控紊乱(幅度，F/F0：2.33±0.10vs1.84±0.07，P＜0.01；频率，bpm：28.47±0.98vs22.89±1.29，P＜0.05；达峰时间，ms：355.10±13.11vs481.9±31.21，P＜0.05；回收时程，ms：1500.00±53.65vs2438.00±217.31，P＜0.05)及收缩抑制(0.50±0.07vs0.97±0.05，P＜0.05)。
小结：上述结果提示SNT浓度及时间依赖性影响hiPSC-CMs收缩，在抑制收缩浓度下导致钙调控稳态紊乱。PI3K活性抑制可能是其分子机制。
第二部分SNT在体重复给药对小鼠心脏收缩功能影响
目的：观察SNT重复给药对小鼠心脏收缩功能的影响，验证PI3K活性抑制是其导致心脏收缩功能障碍的潜在分子机制。
方法：
1.成年小鼠分别灌胃给予SNT(40 mg/kg/d)1~2周，小动物超声检测心脏功能。心肌取材分析心指数，透射电镜观察心肌线粒体形态，研究SNT的心肌损伤。试剂盒检测PI3K及SERCA的活性。
2.利用Langendorff离体心脏灌流，酶解法分离心脏左室心肌细胞。单细胞动缘检测系统检测心肌细胞收缩力，以肌小节缩短幅度(△BL%)和肌小节收缩最大速率(Max dv/dt)代表单心肌细胞收缩力。全细胞膜片钳技术记录心肌细胞ICa,L，并通过细胞膜电容分析电流密度(pA/pF)。激光共聚焦线扫模式记录急性分离心肌细胞的钙调控情况，分析钙瞬变幅度、钙瞬变达峰时间及钙回收时程，应用咖啡因刺激诱导肌浆网钙释放记录肌浆网钙储备。
3.取左室游离壁心肌组织，提取全蛋白，应用Western-Blot检测相关钙调蛋白水平。主要包括：RyR2、Cav1.2、SERCA2a、CaMKII；以及相关蛋白的磷酸化水平：RyR2-S2808、RyR2-S2814、p-CaMKII。以α-tubulin作为内参，对蛋白水平进行定量分析。
结果：
1.成年小鼠灌胃给予SNT(40 mg/kg/d)2周，心肌PI3K活性呈现随时间依赖性降低(1、2周分别是对照的63.6%和41.5%，P＜0.01)，超声心动显示心功能减弱(左室射血分数LVEF1、2周分别是对照的79.6%和72.4%，P＜0.05；左室短轴缩短率LVFS1、2周分别是对照的74.1%和66.1%,P＜0.01)。经过Pearson线性分析，发现左室收缩功能(LVEF)和PI3K活性存在显著线性相关(r=0.77，P＜0.001)，心脏收缩功能随PI3K活性的降低逐渐减弱。
2.透射电镜结果显示，给药4天后线粒体形态没有明显的改变。但给药7天后，线粒体脊和膜出现融合消失；给药14天后，线粒体损伤进一步加重，并出现空泡化。酶联免疫吸附试剂盒(ELISA)实验结果发现，正常心肌SERCA活性为2.54±0.24(n=5)，给药7天和14天后分别减弱为0.89±0.25(n=5)和0.53±0.10(n=5)(P＜0.01)。
3.心肌细胞收缩功能及ICa,L：单细胞收缩呈给药时间延长逐步减弱(肌小节收缩幅度给药1、2周分别是对照的56.6%和41.6%，P＜0.01；肌小节最大收缩速率分别为55.9%和48.6%)(P＜0.01)。心肌细胞钙电流也随给药时间延长逐步减小(1、2周和对照相比分别下降了50.9%和57.7%)(P＜0.01)。
4.心肌细胞钙调控情况：随着给药时间延长钙调控紊乱逐步严重。钙瞬变幅度下降，给药1、2周分别是对照的83.7%和77.67%(P＜0.01)；钙瞬变达峰时间逐步延长，1、2周分别是对照的117.6%和223.6%(P＜0.01)；钙回摄时程延长，1、2周分别是对照的159.9%和226.1%(P＜0.01)；肌浆网钙储备减少，1、2周分别是对照的67.4%和60.4%(P＜0.05)。心肌SERCA活性也随给药时间延长，逐步降低(给药1、2周分别是对照的35.0%和20.9%，P＜0.01)。
5.钙调蛋白表达及磷酸化水平：给药7天时，钙调蛋白RyR2、Cav1.2、SERCA2a、CaMKII水平均未发生显著的改变(P＞0.05)；RyR2的PKA和CaMKII磷酸化位点RyR2-S2808和RyR2-S2814，以及CaMKII自身磷酸化p-CaMKII表达水平也均未发生改变(P＞0.05)。给药14天后，Cav1.2和SERCA2a蛋白表达降低，分别是对照的61.7%(n=5，P＜0.01)和72.0%(n=5，P＜0.05)；而RyR2、CaMKII及其相关磷酸化水平均未发生改变(P＞0.05)。
小结：
1.SNT在体重复给药显著降低PI3K活性、抑制心肌收缩，二者存在显著相关性。
2.SNT重复给药导致心肌细胞LTCC功能降低，细胞内钙瞬变减少、SERCA活性减弱，肌浆网钙释放和回摄功能抑制是其主要机制。
第三部分上调PI3K对SNT导致小鼠心脏收缩功能障碍的保护作用
目的：心肌特异性过表达p110α(心脏中PI3K的主要亚型)，验证激活PI3K对SNT导致小鼠心脏收缩功能障碍的保护作用。
方法：
1.成年小鼠尾静脉注射腺相关病毒载体rAAV9-caPI3K过表达p110α(rAAV9-EGFP为对照)，感染4周后取心、肝、脾、肺、肾以及骨骼肌等组织，Western-Blot验证腺相关病毒感染的心肌特异性及过表达效率。感染成功后，分别灌胃给予SNT(40 mg/kg/d)1~2周，小动物超声检测心脏功能。
2.利用Langendorff离体心脏灌流，酶解法分离心脏左室心肌细胞。单细胞动缘检测系统检测心肌细胞收缩力，以肌小节缩短幅度(△BL%)和肌小节收缩最大速率(Max dv/dt)代表心肌细胞收缩力。全细胞膜片钳技术记录心肌细胞ICa,L，并通过细胞膜电容分析电流密度(pA/pF)。激光共聚焦线扫模式记录急性分离心肌细胞的钙调控情况，分析钙瞬变幅度、钙瞬变达峰时间及钙回收时程，应用咖啡因(10 mM)刺激诱导肌浆网钙释放记录肌浆网钙储备。
3.取左室游离壁心肌组织，提取全蛋白，应用Western-Blot检测p110α过表达对SNT导致相关钙调蛋白水平降低的保护作用。
结果：
1.腺相关病毒感染尾静脉注射4周后，不同组织检测目的蛋白表达情况，结果表明成功在心脏特异性过表达PI3K(p110α)。rAAV9-caPI3K感染四周后p-AKT表达水平比对照组升高约45%(n=5，P＜0.01)，PI3K/AKT信号通路显著激活。单独注射rAAV9-caPI3K或rAAV9-EGFP对小鼠心功能没有影响。
2.小鼠心肌过表达p110α后，可显著预防SNT导致心脏收缩功能障碍：病毒感染4周后，SNT给药1周和2周，p110α过表达组LVEF为57.64%和59.90%，较单用SNT组(48.35%和42.27%)有显著的预防作用(P＜0.01)；p110α过表达组LVFS分别为30.00%和31.67%，较单用SNT组(24.00%和20.43%)有显著的预防作用(P＜0.01)。单独p110α过表达不会影响心脏收缩功能。
3.小鼠心肌过表达p110α后，可显著预防SNT导致心脏单细胞收缩减弱及ICa,L减小：病毒感染4周后，SNT给药1周和2周，过表达p110α组单细胞肌小节收缩幅度较对照组升高17.05%和16.36%，较单用SNT组(和对照组比分别下降50.77%和55.66%)具有明显预防作用(P＜0.01)；和对照组相比，过表达p110α组肌小节最大收缩速率和对照比分别升高10.19%和降低4.73%，较单用SNT组(和对照组比分别下降50.64%和63.09%)具有明显预防作用(P＜0.01)。SNT给药2周后，和对照组相比，过表达p110α组心肌细胞ICa,L下降1.10%，明显低于单用SNT组(49.12 %)(P＜0.01)。
4.小鼠心肌过表达p110α后，显著预防SNT导致钙调控紊乱，SNT给药1周和2周，和对照组相比，p110α过表达组钙瞬变幅度(F/F0)分别下降3.59%和4.93%，明显低于单用SNT组(21.52%和26.01%)(P＜0.01)；和对照组相比，p110α过表达组钙瞬变达峰时间(ms)分别延长5.60%和14.05%，明显低于单用SNT组(26.56%和145.73%)(P＜0.01)；和对照组相比，p110α过表达组钙回收时程(ms)分别延长4.40%和9.57%，明显低于单用SNT组(62.93%和125.83%)(P＜0.01)；和对照组相比，p110α过表达组肌浆网钙储备(F/F0)分别下降7.69%和1.27%，明显低于单用SNT组(32.84%和37.78%)(P＜0.01)。
5.小鼠心肌过表达p110α后，显著预防SNT导致钙调蛋白表达降低。SNT给药14天后，过表达p110α组Cav1.2表达较对照组下降17.0%，明显低于单用SNT组(60.0 %)(n=6，P＜0.01)；而过表达p110α组SERCA2a表达较对照组下降28.0%，和单用SNT组(31.0 %)没有显著差异(n=6，P＞0.05)。
小结：上调PI3K信号通路可明显对抗SNT引发的心肌细胞钙调控紊乱、钙调蛋白表达降低，从而改善收缩功能障碍，可望成为SNT导致心脏收缩功能障碍的有效保护策略。
结论：本研究在整体、离体细胞水平表明心脏特异性激活PI3K显著保护SNT导致心肌细胞内钙紊乱、心脏收缩减弱。研究结果将为TKIs类药物研发及临床防治该类药物心脏毒性提供参考。
心肌细胞的兴奋-收缩耦联是心肌收缩功能的关键环节。心肌细胞膜去极化后，Ca2+通过激活的电压依赖型L型钙通道(LTCC，Cav1.2)进入细胞。钙诱导钙释放作用(Ca2+-inducedCa2+release，CICR)使Ca2+通过雷诺丁受体(ryanodine receptors，RyR2)从肌浆网(sarcoplasmic reticulum， SR)释放到胞浆，Ca2+瞬变达到峰值，Ca2+与肌钙蛋白C结合，心肌收缩。心肌舒张需要游离Ca2+浓度降低，使Ca2+与肌钙蛋白分离，主要通过四个途径将Ca2+从胞浆中转运，包括肌浆网Ca2+-ATPase(SERCA)，细胞膜Na+/Ca2+交换(NCX)，细胞膜Ca2+-ATPase或线粒体Ca2+单向转运。受磷蛋白(Phospholamban，PLB)是SERCA的内源性抑制剂，环磷酸腺苷依赖的蛋白激酶或者钙调蛋白(PKA/CaMKII)能够磷酸化PLB，解除其对SERCA的抑制作用，加快钙回摄，增强心肌收缩力。
有研究发现，SNT可浓度依赖性降低钙瞬变、从而减弱心房组织的肌张力。离体细胞实验发现，伊马替尼(Imatinib，是一个与SNT类似的多靶点TKI药物)会显著性激活新生大鼠心肌细胞(NRVMs)的CaMKII活性，导致钙调控异常，引发心肌毒性。索拉非尼(Sorafenib，另一个多靶点TKI药物)急性作用会导致心肌细胞SR钙储备降低33%、钙瞬变降低50%，从而减小细胞收缩力。上述结果提示心肌肌浆网钙储备减少导致钙瞬变幅度降低是SNT导致收缩障碍的原因。那么其分子机制是什么？
近几年人们试图寻找TKIs的直接作用靶点和心脏毒性之间的关系，结果并未发现引发心脏毒性的特异性TK。TKIs可能是通过抑制TK下游的信号通路(靶向作用)或者TK以外的其他激酶(脱靶作用)，导致心脏收缩功能障碍。前期实验结果表明TKI造成心肌毒性时伴随细胞内激酶信号通路活性的改变，主要包括AMPK、CaMKII、PKA和PI3K。SNT可显著抑制AMP激活的蛋白激酶(AMPK)。Imatinib和SNT急性作用导致豚鼠心肌CaMKIIδ活性和表达增高。SNT会导致PKA活性降低，引发心肌线粒体损伤、心肌纤维化和心脏功能障碍。另外，Dasatinib、Sunitinib和Nilotinib会抑制心肌细胞PI3K活性和表达。已知CAMKII、AMPK、PKA以及PI3K等激酶均可直接或间接影响心肌细胞钙稳态，因此我们设想，干预上述激酶活性可能预防TKI引发的心脏收缩功能紊乱。
为验证上述假设，本研究首先在人诱导干细胞分化的心肌细胞(hiPSC-CMs)上采用激酶的药理学抑制剂或激动剂找出保护SNT引发心脏收缩功能障碍最有效的干预通路，然后在动物水平进一步验证其对SNT引发钙调控紊乱-收缩功能障碍的作用。为临床防治SNT造成的心室收缩障碍提供新的思路。
第一部分干预激酶活性对SNT引发hiPSC-CMs收缩紊乱的影响
目的：寻找保护SNT导致hiPSC-CMs收缩抑制和钙调控紊乱的激酶靶点。
方法：
1.免疫荧光观察心肌细胞标志物，验证hiPSC-CMs的纯度。
2.利用CardioExcyte96心肌细胞实时监测系统，观察SNT对hiPSC-CMs收缩的影响。激光共聚焦系统观察SNT对hiPSC-CMs钙瞬变的影响。观察以下激酶激动剂或抑制剂：PKA抑制剂H89，CaMKII抑制剂KN-93，AMPK激动剂Metformin和AICAR，PI3K活性物质PI(3,4,5)P3对细胞收缩的影响。
3.进一步观察(腺病毒中介)过表达细胞PI3K(p110α)，对SNT引发钙瞬变、细胞收缩紊乱的影响。
结果：
1.hiPSC-CMs复苏、培养7天后，免疫荧光实验发现心肌特异标志物α-Actin和TNNT2可以显著表达，心肌细胞纯度达到90%以上。
2.SNT(0.5~20?M)在72小时内呈浓度依赖性和时间依赖性抑制hiPSC-CMs收缩，72小时测得IC50为2.142?M。SNT2?M减小钙瞬变幅度(F/F0)(2.25±0.11vs1.84±0.07,P＜0.05)和频率(bpm)((29.95±1.29vs22.89±1.29，P＜0.01)，延长钙瞬变达峰时间(ms)(355.80±23.47vs481.9±31.21，P＜0.05)和钙回收时程(ms)((1298.00±77.20vs2438.00±217.31，P＜0.01)。SNT给药前4小时孵育PIP3(1?M)以激活PI3K，能够明显减轻SNT引发的钙瞬变幅度(F/F0)(2.31±0.13vs1.84±0.07，P＜0.05)和频率(bpm)((30.67±0.74vs22.89±1.29，P＜0.01)降低，以及钙瞬变达峰时间(ms)(362.00±14.18vs481.9±31.21，P＜0.05)和回收时程(ms)(1369.00±56.98vs2438.00±217.31，P＜0.01)延长，并且显著预防SNT对收缩(0.49±0.04vs1.07±0.13，P＜0.05)的抑制。而SNT给药4小时前孵育CAMKII选择性抑制剂KN-93(50 nM)、PKA抑制剂H89(1?M)以及AMPK激活剂二甲双胍(2 mM)和AICAR(2 mM)对SNT导致hiPSC-CMs收缩抑制无明显影响(P＞0.05)。
3.SNT给药48小时前腺病毒感染过表达PI3K(p110α)，结果发现与药理学手段激活PI3K一样，过表达p110α能够显著预防SNT导致hiPSC-CMs钙调控紊乱(幅度，F/F0：2.33±0.10vs1.84±0.07，P＜0.01；频率，bpm：28.47±0.98vs22.89±1.29，P＜0.05；达峰时间，ms：355.10±13.11vs481.9±31.21，P＜0.05；回收时程，ms：1500.00±53.65vs2438.00±217.31，P＜0.05)及收缩抑制(0.50±0.07vs0.97±0.05，P＜0.05)。
小结：上述结果提示SNT浓度及时间依赖性影响hiPSC-CMs收缩，在抑制收缩浓度下导致钙调控稳态紊乱。PI3K活性抑制可能是其分子机制。
第二部分SNT在体重复给药对小鼠心脏收缩功能影响
目的：观察SNT重复给药对小鼠心脏收缩功能的影响，验证PI3K活性抑制是其导致心脏收缩功能障碍的潜在分子机制。
方法：
1.成年小鼠分别灌胃给予SNT(40 mg/kg/d)1~2周，小动物超声检测心脏功能。心肌取材分析心指数，透射电镜观察心肌线粒体形态，研究SNT的心肌损伤。试剂盒检测PI3K及SERCA的活性。
2.利用Langendorff离体心脏灌流，酶解法分离心脏左室心肌细胞。单细胞动缘检测系统检测心肌细胞收缩力，以肌小节缩短幅度(△BL%)和肌小节收缩最大速率(Max dv/dt)代表单心肌细胞收缩力。全细胞膜片钳技术记录心肌细胞ICa,L，并通过细胞膜电容分析电流密度(pA/pF)。激光共聚焦线扫模式记录急性分离心肌细胞的钙调控情况，分析钙瞬变幅度、钙瞬变达峰时间及钙回收时程，应用咖啡因刺激诱导肌浆网钙释放记录肌浆网钙储备。
3.取左室游离壁心肌组织，提取全蛋白，应用Western-Blot检测相关钙调蛋白水平。主要包括：RyR2、Cav1.2、SERCA2a、CaMKII；以及相关蛋白的磷酸化水平：RyR2-S2808、RyR2-S2814、p-CaMKII。以α-tubulin作为内参，对蛋白水平进行定量分析。
结果：
1.成年小鼠灌胃给予SNT(40 mg/kg/d)2周，心肌PI3K活性呈现随时间依赖性降低(1、2周分别是对照的63.6%和41.5%，P＜0.01)，超声心动显示心功能减弱(左室射血分数LVEF1、2周分别是对照的79.6%和72.4%，P＜0.05；左室短轴缩短率LVFS1、2周分别是对照的74.1%和66.1%,P＜0.01)。经过Pearson线性分析，发现左室收缩功能(LVEF)和PI3K活性存在显著线性相关(r=0.77，P＜0.001)，心脏收缩功能随PI3K活性的降低逐渐减弱。
2.透射电镜结果显示，给药4天后线粒体形态没有明显的改变。但给药7天后，线粒体脊和膜出现融合消失；给药14天后，线粒体损伤进一步加重，并出现空泡化。酶联免疫吸附试剂盒(ELISA)实验结果发现，正常心肌SERCA活性为2.54±0.24(n=5)，给药7天和14天后分别减弱为0.89±0.25(n=5)和0.53±0.10(n=5)(P＜0.01)。
3.心肌细胞收缩功能及ICa,L：单细胞收缩呈给药时间延长逐步减弱(肌小节收缩幅度给药1、2周分别是对照的56.6%和41.6%，P＜0.01；肌小节最大收缩速率分别为55.9%和48.6%)(P＜0.01)。心肌细胞钙电流也随给药时间延长逐步减小(1、2周和对照相比分别下降了50.9%和57.7%)(P＜0.01)。
4.心肌细胞钙调控情况：随着给药时间延长钙调控紊乱逐步严重。钙瞬变幅度下降，给药1、2周分别是对照的83.7%和77.67%(P＜0.01)；钙瞬变达峰时间逐步延长，1、2周分别是对照的117.6%和223.6%(P＜0.01)；钙回摄时程延长，1、2周分别是对照的159.9%和226.1%(P＜0.01)；肌浆网钙储备减少，1、2周分别是对照的67.4%和60.4%(P＜0.05)。心肌SERCA活性也随给药时间延长，逐步降低(给药1、2周分别是对照的35.0%和20.9%，P＜0.01)。
5.钙调蛋白表达及磷酸化水平：给药7天时，钙调蛋白RyR2、Cav1.2、SERCA2a、CaMKII水平均未发生显著的改变(P＞0.05)；RyR2的PKA和CaMKII磷酸化位点RyR2-S2808和RyR2-S2814，以及CaMKII自身磷酸化p-CaMKII表达水平也均未发生改变(P＞0.05)。给药14天后，Cav1.2和SERCA2a蛋白表达降低，分别是对照的61.7%(n=5，P＜0.01)和72.0%(n=5，P＜0.05)；而RyR2、CaMKII及其相关磷酸化水平均未发生改变(P＞0.05)。
小结：
1.SNT在体重复给药显著降低PI3K活性、抑制心肌收缩，二者存在显著相关性。
2.SNT重复给药导致心肌细胞LTCC功能降低，细胞内钙瞬变减少、SERCA活性减弱，肌浆网钙释放和回摄功能抑制是其主要机制。
第三部分上调PI3K对SNT导致小鼠心脏收缩功能障碍的保护作用
目的：心肌特异性过表达p110α(心脏中PI3K的主要亚型)，验证激活PI3K对SNT导致小鼠心脏收缩功能障碍的保护作用。
方法：
1.成年小鼠尾静脉注射腺相关病毒载体rAAV9-caPI3K过表达p110α(rAAV9-EGFP为对照)，感染4周后取心、肝、脾、肺、肾以及骨骼肌等组织，Western-Blot验证腺相关病毒感染的心肌特异性及过表达效率。感染成功后，分别灌胃给予SNT(40 mg/kg/d)1~2周，小动物超声检测心脏功能。
2.利用Langendorff离体心脏灌流，酶解法分离心脏左室心肌细胞。单细胞动缘检测系统检测心肌细胞收缩力，以肌小节缩短幅度(△BL%)和肌小节收缩最大速率(Max dv/dt)代表心肌细胞收缩力。全细胞膜片钳技术记录心肌细胞ICa,L，并通过细胞膜电容分析电流密度(pA/pF)。激光共聚焦线扫模式记录急性分离心肌细胞的钙调控情况，分析钙瞬变幅度、钙瞬变达峰时间及钙回收时程，应用咖啡因(10 mM)刺激诱导肌浆网钙释放记录肌浆网钙储备。
3.取左室游离壁心肌组织，提取全蛋白，应用Western-Blot检测p110α过表达对SNT导致相关钙调蛋白水平降低的保护作用。
结果：
1.腺相关病毒感染尾静脉注射4周后，不同组织检测目的蛋白表达情况，结果表明成功在心脏特异性过表达PI3K(p110α)。rAAV9-caPI3K感染四周后p-AKT表达水平比对照组升高约45%(n=5，P＜0.01)，PI3K/AKT信号通路显著激活。单独注射rAAV9-caPI3K或rAAV9-EGFP对小鼠心功能没有影响。
2.小鼠心肌过表达p110α后，可显著预防SNT导致心脏收缩功能障碍：病毒感染4周后，SNT给药1周和2周，p110α过表达组LVEF为57.64%和59.90%，较单用SNT组(48.35%和42.27%)有显著的预防作用(P＜0.01)；p110α过表达组LVFS分别为30.00%和31.67%，较单用SNT组(24.00%和20.43%)有显著的预防作用(P＜0.01)。单独p110α过表达不会影响心脏收缩功能。
3.小鼠心肌过表达p110α后，可显著预防SNT导致心脏单细胞收缩减弱及ICa,L减小：病毒感染4周后，SNT给药1周和2周，过表达p110α组单细胞肌小节收缩幅度较对照组升高17.05%和16.36%，较单用SNT组(和对照组比分别下降50.77%和55.66%)具有明显预防作用(P＜0.01)；和对照组相比，过表达p110α组肌小节最大收缩速率和对照比分别升高10.19%和降低4.73%，较单用SNT组(和对照组比分别下降50.64%和63.09%)具有明显预防作用(P＜0.01)。SNT给药2周后，和对照组相比，过表达p110α组心肌细胞ICa,L下降1.10%，明显低于单用SNT组(49.12 %)(P＜0.01)。
4.小鼠心肌过表达p110α后，显著预防SNT导致钙调控紊乱，SNT给药1周和2周，和对照组相比，p110α过表达组钙瞬变幅度(F/F0)分别下降3.59%和4.93%，明显低于单用SNT组(21.52%和26.01%)(P＜0.01)；和对照组相比，p110α过表达组钙瞬变达峰时间(ms)分别延长5.60%和14.05%，明显低于单用SNT组(26.56%和145.73%)(P＜0.01)；和对照组相比，p110α过表达组钙回收时程(ms)分别延长4.40%和9.57%，明显低于单用SNT组(62.93%和125.83%)(P＜0.01)；和对照组相比，p110α过表达组肌浆网钙储备(F/F0)分别下降7.69%和1.27%，明显低于单用SNT组(32.84%和37.78%)(P＜0.01)。
5.小鼠心肌过表达p110α后，显著预防SNT导致钙调蛋白表达降低。SNT给药14天后，过表达p110α组Cav1.2表达较对照组下降17.0%，明显低于单用SNT组(60.0 %)(n=6，P＜0.01)；而过表达p110α组SERCA2a表达较对照组下降28.0%，和单用SNT组(31.0 %)没有显著差异(n=6，P＞0.05)。
小结：上调PI3K信号通路可明显对抗SNT引发的心肌细胞钙调控紊乱、钙调蛋白表达降低，从而改善收缩功能障碍，可望成为SNT导致心脏收缩功能障碍的有效保护策略。
结论：本研究在整体、离体细胞水平表明心脏特异性激活PI3K显著保护SNT导致心肌细胞内钙紊乱、心脏收缩减弱。研究结果将为TKIs类药物研发及临床防治该类药物心脏毒性提供参考。