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小麦是世界上重要的粮食作物之一,开花是其从营养生长向生殖生长的转变的重要时期,小麦开花发育调控直接影响着其产量,而小麦产量一直是小麦科研关注的重点。因此,开展小麦开花发育调控的研究具有重要价值。研究表明,组蛋白甲基化修饰与植物开花调控密切相关。组蛋白甲基转移酶(SET Domain Group,SDG)直接参与组蛋白甲基化修饰的关键因子,在植物的开花调控中发挥着重要的功能,本实验从小麦中分别分离克隆了编码组蛋白H3K36甲基化修饰的甲基转移酶Ta SDG7和Ta SDG8,成功筛选了其来源于A,B,D的部分同源基因,系统分析其时空表达特性,并利用拟南芥突变体和基于大麦条纹花叶病毒(BSMV)介导基因沉默,初步验证了SDG7/8在小麦发育调控过程中的生物学功能。主要研究结果如下:1.在前期克隆Ta SDG7和Ta SDG8部分c DNA的基础上,结合生物信息学和RT-PCR技术克隆了其来源于A,B,D基因组的部分同源基因,结果表明:Ta SDG7在小麦中有6个成员,分别被定位在了第五同源染色群和第七同源染色体群的长臂上,根据定位依次命名为Ta SDG7-5AL、Ta SDG7-5BL和Ta SDG7-5DL以及Ta SDG7-7AL、Ta SDG7-7BL、Ta SDG7-7DL。基因组分析结果显示,Ta SDG7均由11个外显子和10个内含子组成。对6个成员编码的蛋白的分析结果显示,Ta SDG7-5AL/BL/DL分别编码261、362和447个氨基酸,分子量依次为30.39 k Da、41.35 k Da和50.86 k Da;Ta SDG7-7AL/BL/DL分别编码338、340和338个氨基酸,分子量分别为39.08 k Da、39.38 k Da和39.04 k Da。进一步的结构域分析发现,Ta SDG7的6个成员均含有SET和AWS结构域,这些结构域对组蛋白的甲基化修饰具有重要功能,三维结构预测显示,Ta SDG7-5DL由3个α-螺旋和10个β-折叠组成,由于Ta SDG7-5AL比Ta SDG7-5DL缺失186个氨基酸,在N端Ta SDG7-5AL比Ta SDG7-5DL少了1个α-螺旋,由于Ta SDG7-5BL比Ta SDG7-5DL缺失了86个氨基酸,在N端Ta SDG7-5BL比Ta SDG7-5DL少了2个β-折叠;Ta SDG7-7AL/BL/DL均由4个α-螺旋和13个β-折叠以及无规则卷曲组成,推测来源于第五同源染色群Ta SDG7三个部分同源在小麦生长发育过程中可能发挥着不同的功能。Ta SDG8包含有3个部分同源基因,被定位于第二同源染色群的短臂上,依次命名为Ta SDG8-2AS、Ta SDG8-2BS、Ta SDG8-2DS。Ta SDG8-2AS/BS基因均由16个内含子和17个外显子组成,而Ta SDG8-2DS由10个内含子和11个外显子组成。Ta SDG8-2AS/BS/DS分别编码1088、1070和707个氨基酸,分子量依次为120.68 k Da、119.46 k Da和78.00 k Da。结构域结果分析显示,Ta SDG8包含有SET、AWS和zf-cw三个保守域。由于小麦组蛋白甲基转移酶Ta SDG7和Ta SDG8具有两个相同的结构域SET和AWS,推测其二者具有相似的功能,但Ta SDG8还包含zf-cw结构域,该结构域在与DNA结合,并促进蛋白质与蛋白质之间的相互作用中可能发挥重要功能,因此推测其可能对Ta SDG8的转移酶活性有增强效应,具体机制有待于下一步实验验证。三维结构预测显示来源三个基因组的Ta SDG8均形成由有2个α-螺旋和13个β-折叠的特定结构。进化树聚类分析显示,Ta SDG7-5AL/BL/DL和Ta SDG7-7AL/BL/DL以及Ta SDG8-2AS/BS/DS均属于SDG家族的第五个亚家族,即Suv亚家族。2.为了验证Ta SDG7和Ta SDG8基因的体外活性,构建了原核表达载体,SDS-PAGE结果表明成功诱导表达融合蛋白GST-Ta SDG7-7L,该融合蛋白的分子量大小为66.0 k Da,与预期大小相一致。Ta SDG8-2S表达量低,下一步将进一步优化GST-Ta SDG8-2S表达条件,并开展Ta SDG7和Ta SDG8体外活性研究。3.为了探讨时空表达模式,以“京841”和“中国春”的根、茎、叶、胚、胚乳和干种子的c DNA为模板,q RT-PCR结果表明:Ta SDG7-5AL/BL/DL和Ta SDG8-2AS/BS/DS的部分同源基因整体表达水平均在叶片中最高,在胚乳中表达量最低,对于不同成员来说,Ta SDG7/8-B的表达水平依次高于Ta SDG7/8-A和Ta SDG7/8-D,推测来源于B基因组的Ta SDG7和Ta SDG8基因的在小麦中发挥有重要作用。来源于第七同源染色群的Ta SDG7-7AL/BL/DL第表达量均极低,推测其可能不参与小麦发育调控。4.春化特性是影响小麦开花调控的重要通路,为了探究Ta SDG7/8基因对小麦春化处理的响应,分别以冬性品种“京841”、半冬性“郑育麦9987”和春性“中国春”为材料,利用q RT-PCR系统分析了萌动种子在春化处理过程中的表达模式,结果表明,相对于郑育麦9987和中国春,Ta SDG7-5L在京841中上调表达持续时间较短,推测其低表达可能与冬性小麦春化密切相关,进一步分析发现,在春化处理过程中,Ta SDG7-5AL表达量最高,Ta SDG7-5DL表达量最低。Ta SDG8-2BS的表达量高于Ta SDG8-2AS/2DS,推测来源B基因组的Ta SDG8在小麦春化过程中可能发挥重要作用。5.小麦籽粒是重要的储存器官和播种材料,因此,种子发育和萌发过程的调控对小麦生长发育具有重要影响。本文分别以小粒品种“中国春”和大粒品种“郑育麦9987”为材料,系统分析了Ta SDG7/8基因在小麦籽粒发育过程中的表达特性,结果表明,Ta SDG7-5L在郑育麦9987中的表达出现上调,并且在籽粒发育20 d表达量达到最高,其中20d是小麦籽粒灌浆的关键时期,推测其可能与小麦籽粒形成的大小有关。在15 DAP时,Ta SDG8-2S在“郑育麦9987”的表达量远高于“中国春”,推测Ta SDG8-2S可能与郑育麦9987籽粒相对于中国春较大的发育调控有关。为了探究Ta SDG7/8基因对小麦籽粒萌发过程中的表达特性,以“京841”和“中国春”的胚和胚乳为材料,结果表明,Ta SDG7-5L在萌发24 h表达量最高,在“中国春”中,Ta SDG7-5L在萌发12 h的胚中表达量最高。Ta SDG7-5L三个部分同源基因的表达量大小依次为Ta SDG7-5AL>Ta SDG7-5BL>Ta SDG7-5DL,Ta SDG8-2S三个部分同源基因的表达量大小依次为Ta SDG8-2BS>Ta SDG8-2A/DS,表明三个A、B和D同源基因在种子萌动过程中的作用不同,这是否与小麦的发育特性有关有待于进一步探究。6.为了探讨Ta SDG7/8的生物学功能,本实验对拟南芥突变体sdg7/8(+/-)进行Ta SDG8的过表达,目前已经筛选到4株Ta SDG8转基因拟南芥,下一步将对其后代进行基因分离的筛选,以获得纯合转基因植株。同时,利用大麦条纹花叶病毒(BSMV)介导的基因沉默技术开展了小麦研究。结果发现,接种BSMV-Ta SDG8的植株,q RT-PCR分析显示接种后Ta SDG8表达明显降低,表明实现了对目的基因的降解,但与对照相比没有观察到表型差异,进一步将BSMV-Ta SDG7和BSMV-Ta SDG8混合后接种,结果显示当Ta SDG7和Ta SDG8被同时抑制后,小麦植株表现出分蘖数明显增加,比对照多4-6个分蘖,并且植株出现明显矮小的表型,这表明Ta SDG7和Ta SDG8之间可能存在一定互补效应,具体机制有待于进一步研究。为了获得永久转化体,构建了Ta SDG8-2S的RNAi抑制载体,并实现了农杆菌介导的小麦遗传转化。目前,已获得T0代小麦种子,T1代植株的转基因分子鉴定还在进行。下一步我们将开展Ta SDG7的RNAi抑制表达,以及通过Ta SDG7和Ta SDG8抑制表达转基因植株的杂交筛选双突变的小麦转基因材料,验证Ta SDG7和Ta SDG8在小麦生长发育过程中的生物学功能。