昆虫的表皮是和外界环境直接接触的重要结构,一方面能够提供外形的支撑,同时还保护昆虫抵御外界的伤害。昆虫表皮组织的成分非常复杂,包括几丁质,表皮蛋白和脂类物质(包括碳氢化合物)等,一些昆虫的体表还能观察到基于儿茶酚胺途径代谢产生的黑色素斑纹。昆虫表皮碳氢化合物作为其中重要的组分,和其他表皮物质之间联系的研究目前还比较少。CYP4G亚家族是细胞色素P450家族成员之一,参与到了昆虫碳氢化合物的合成过程中,可通过改变其转录水平或酶活性引起碳氢化合物含量的变化。异色瓢虫属于鞘翅目瓢甲科,是一种完全变态昆虫,对环境具有极强的适应性,广泛分布于中国的大部分地区。其成虫和蛹的表皮上的黑色素斑点规律性很强,且会跟随环境的变化而改变,形成多种色斑形式,在其调节体表温度、躲避天敌等方面具有重要的作用。CYP4G79是目前在异色瓢虫体内发现的唯一一种CYP4G基因,其在虫体内的功能需要进一步的研究。基于以上的这些问题开展了一系列的实验。首先对CYP4G79基因进行了时空表达分析并利用气相色谱质谱联用技术(GC-MS)检测了目的基因被干扰后蛹表皮的碳氢化合物成分的定量变化,探究RNAi对异色瓢虫表皮成分的影响。之后筛选出了高低两种浓度的ds RNA并对异色瓢虫四龄幼虫进行基因干扰实验,对比两种浓度的ds RNA的干扰效率及最终产生的表型差异;同时,利用实时荧光定量PCR检测低强度RNAi后异色瓢虫体内黑化相关基因的表达情况,探究表皮碳氢化合物合成与表皮黑化之间的相关性。在此基础上,我们结合体表碳氢化合物在昆虫保水中的作用,探究了CYP4G79在异色瓢虫体内的其他功能。首先,我们设置了不同的湿度条件以探究湿度是否会影响异色瓢虫蛹期的表型及CYP4G79的转录水平;并进一步通过RNAi调控CYP4G79的表达水平,检测处理前后异色瓢虫蛹的含水量及气门大小,验证CYP4G79调控的碳氢化合物合成代谢对虫体保水功能的影响。通过以上的研究,得到了以下的结论:通过对CYP4G79的时空表达分析,发现在异色瓢虫幼虫期和蛹期不同的发育历期中,四龄幼虫CYP4G79的表达量最高;表皮和脂肪体中CYP4G79的表达量相对较高。通过检测基因干扰后蛹表皮碳氢化合物的成分变化,目的基因表达下调后的异色瓢虫蛹表皮中部分碳氢化合物的含量有明显的下降,这就说明CYP4G79在异色瓢虫的碳氢化合物生物合成中确实发挥着作用。在不同程度的RNA干扰实验中,发现高剂量ds RNA干扰后新蛹的CYP4G79表达量显著下调,但仅有少量存活下的蛹表现出严重的表型改变;低剂量ds RNA处理后瓢虫的存活率显著高于高剂量ds RNA组。另外,在低强度的RNAi后,黑化相关基因lac2和ebony的表达量显著上调,同时异色瓢虫蛹背部表皮上的黑斑则明显增大;异色瓢虫蛹背面中线的中心凹陷周围以及各体节的气门处表皮组织的黑色素沉积水平升高。这些结果说明表皮碳氢化合物和黑色素的合成在结构上和转录水平上均存在一定的相关性,扫描电子显微镜(SEM)的结果在一定程度上也间接证实了此推论。而高强度RNAi后,蛹表皮的黑色素斑边缘变得模糊,黑斑的对称性明显被破坏。对蛹的表皮组织切片结果显示ds RNA处理后的异色瓢虫的表皮组织变薄,内表皮的显微结构也明显被破坏,黑斑边缘部位斑点的色素沉积出现异常。免疫荧光染色实验的结果表明,TH蛋白染色在皮细胞层中均能够呈现免疫反应阳性,但处理组(ds-CYP4G79)的荧光强度更弱;除此之外,TH蛋白在CYP4G79-RNAi组织中的分布较为不规则,且聚集成团。这些实验证明表皮层色素异常可能是由表皮微结构的改变引起的生理变化。在环境湿度较低的条件下,CYP4G79的表达量明显上调。蛹在CYP4G79干扰处理后,蛹内含水量略有下降,各体节的气门面积有明显的增大。扫描电镜的结果显示,基因干扰后蛹翅膀和腹部体节的表皮发生了皱缩和塌陷。另外,在较高的湿度下,异色瓢虫蛹腹部的黑斑略变大。这一系列实验都说明该基因在维持异色瓢虫体内水分平衡方面确实发挥着很重要的作用,同时也证实了黑化途径对湿度的刺激有反应,并产生了相应的反馈。综上,我们可以得出结论,CYP4G79在异色瓢虫的碳氢化合物生物合成中发挥着重要的作用,并且异色瓢虫表皮的碳氢化合物和黑色素之间存在着一定的联系。较高湿度或基因干扰后斑点变大的现象表明,这种相互作用可能是基于它们的上游调节机制并具有一定的生理功能,反映了异色瓢虫对环境的适应性;严重的表型改变则表明表皮碳氢化合物对昆虫表皮形成是重要且必要的。本研究进一步加深了我们对昆虫适应环境、表皮形成及其功能的认识。