新菌株P.expansum SK16(生长于大丽菊坏茎)产菊糖酶的纯化、性质和应用研究

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大丽菊属菊科,是一种多年生草木,株高1米,花期6-10月。根部富含淀粉菊糖,虽然人体不能将其吸收,但是这一淀粉可在体内转化为果糖,而果糖适合糖尿病人使用。近年来由于果糖的甜度、良好的特性以及糖价的大幅增加,果糖的生产一直稳步增长。商业化生产果糖是通过将玉米淀粉转化为葡萄糖,再将葡萄糖异构化成果糖实现的。这样得到的糖浆果糖含量达42%。经多级色谱分离可以选择性地去除葡萄糖,从而糖浆中果糖含量可提高至55%或90%(称为高果糖玉米糖浆,HFCS)。这些技术费用较高,因而果糖价格不低,从而限制其作为一般甜味剂使用。将富含果糖的植物水解得到果糖已成为一种潜在的极具前景的方法。由于微生物易培养、产酶量高,所以成为生产菊粉酶的最佳来源。同时,有益微生物和微生物催化应用研究对于未来生物技术的发展也是至关重要的。人们对纯果糖浆的需求日益增强,菊粉酶为纯果糖浆的生产提供了新的思路。不同于传统的从淀粉中制备,菊粉生产所谓的超高果糖葡萄糖浆可能也是一种代替方法。不同微生物得到的菊粉酶的性质不同,一般来说,它的分子量大于50.0kDa,最适pH值介于4.5-7.0之间,最适温度在30℃-60℃。将富含果糖的植物水解得到果糖是潜在的生产果糖的一种途径。本文旨在首次筛选、分离和鉴定生产低聚果糖或果糖的新菌株,之后通过优化新菌株的发酵条件以提高菊粉酶的产量。根据其形态和生化特征,以及18S rRNA,此菌株被中国典型培养物保藏中心(CCTCC)鉴定为P. expansum,保藏号GU561988。而且,从接种量, pH值,温度,碳源,氮源对菊粉酶形成的最佳条件进行了研究,发现菊粉是其唯一的碳源。此外,经硫酸铵沉淀、DEAE FF离子交换柱和superdex200凝胶柱纯化,菊粉酶达到电泳纯的级别。单因素实验对P. expansum SK16生产菊粉酶的条件进行优化。结果表明,碳源为4%菊粉,氮源为0.7%的鱼粉蛋白胨时菊粉酶的产量最高。此外,在培养基pH值5.0,接种量5%的条件下28℃发酵4天,菊粉酶产量很高。不同的缓冲液对菊粉酶活性有很大的影响,其中以醋酸钠缓冲液为最好。菊粉酶的pH曲线显示的最佳pH值在5.0左右。鉴于pH稳定性,菊粉酶的活性在pH4.5-6.5范围内室温下2h内都很稳定。菊粉酶的温度曲线显示大约50℃为菊粉酶的最适温度。考虑到热稳定性,菊粉酶在50℃温度下6h后酶活没有明显的损失,仍保持稳定。研究发现,2h后酶活也仅降低了20%。这些特性有利于大规模利用菊粉酶生产纯果糖。实际上,高的操作温度能避免微生物污染反应器,并可以利用高浓度的菊糖底物,这一因素是获得高转化率的关键。另外,尽可能低的pH可以阻止颜色生成以及不期望的化学反应的发生。通过采用高效液相色谱法(HPLC)对菊糖的水解产物进行了分析。结果显示,果糖是菊糖水解的主要产物,此结果表明在大丽菊根茎中提取得到的菊粉酶是一种外切菊粉酶。纯化后的菊粉酶经过SDS-PAGE电泳检测为电泳纯,相对分子量约为66kDa。因此发现,P. expansum SK16菌株是一种可以产生菊粉酶的霉菌。
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