在水产养殖中,鱼类经常会遇到水温剧变、养殖密度过高、水质恶化、鱼体运输、存贮等环境因子的应激。当病原找到适合自身繁殖的环境时,这些应激因子的改变更容易引起鱼体感染疾病。鱼是变温动物,它依靠免疫反应来抵抗病原的感染,更多的是依靠环境的温度,过高或过低的温度能引起水产动物生理机能发生变化,造成鱼体易受病原感染,甚至引起鱼体的死亡。因此,如何防止应激和减轻应激的危害是当前研究的热点。中草药大黄蒽醌提取物包括大黄素、大黄酚、大黄酸等,可作为免疫增强剂在动物中使用,具有一定抗应激作用。团头鲂(Megalobrama amblycephala)又叫武昌鱼、鳊鱼。从上世纪60年代以来,一直是我国主要的淡水养殖品种之一,与青、草、鲢、鳙、鲤、鲫等大宗淡水鱼类一起提供了大量的水产品,2011年产量超过了60万吨。近年来,团头鲂的病害情况在生产中时有发生,特别在夏季高温季节容易造成鱼体发病,甚至造成鱼体死亡。鉴于此,本实验首先分离、克隆了团头鲂热应激蛋白60(HSP60)、热应激蛋白90β(HSP90β) cDNA全序列,研究高温急性与慢性应激及恢复对团头鲂生理机能的影响,在此研究的基础上,研究大黄蒽醌提取物对抗高温应激、抗高密度应激及抗病原菌感染调控机理。从不同的生理层次系统地探讨应激与大黄蒽醌提取物与鱼体生长、激素分泌、免疫和热应激蛋白(HSPs)表达之间的关系,探索鱼类高温应激作用机制及调控机理,为进一步鱼类应激研究提供新的思路。1团头鲂热应激蛋白60和90基因克隆、序列分析与组织表达的影响团头鲂HSP60全长cDNA共2253bp,包括59bp5’非翻译区,1728bp阅读框以及含Poly(A)信号AATAAA的466bp3’非翻译区[不包括Poly(A)].阅读框共编码575个氨基酸,计算的分子量为61.24kDa。与其他鱼HSP60的相似性高达88%-99%,和南美白对虾(Litopenaeus vannamei).果蝇(Drosophila melanogaster)以及人Homo sapiens)的HSP60的相似性高达70%-85%。团头鲂HSP90β全长cDNA共2676bp,包括89bp5’非翻译区,2253bp阅读框以及含Poly(A)信号AATAAA的334bp3’非翻译区[不包括Poly(A)].阅读框共编码750个氨基酸,计算的分子量为86.16kDa。与其他鱼HSP90β的相似性高达92%-97%,刀额新对虾(Metapenaeus ensis)和果蝇(Drosophila melanogaster)HSP90的相似性高达78%-80%。通过荧光定量表明了HSP60、HSP70、HSP90β在心与脑中的表达较高,其次是’肾脏与脾脏,在肝脏中的表达较少。2急性与慢性高温应激对团头鲂生理生化、免疫及应激蛋白基因表达影响实验选取平均体重为(77±2.18)g的团头鲂180尾作为实验对象,设定常温(25±1)℃对照组和高温(32+1)℃冷应激试验组,每组设定5个平行组,分别在0.25d/、0.5d、Id、2d、7d、14d、21d随机采样,测定血清血糖(GLU)、胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、补体3(C3)、补体4(C4)、溶菌酶(LSZ)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质醇(COR)、胰岛素(Insulin)、三碘甲腺原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)以及肝脏抗超氧阴离子(ASAFR)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及应激蛋白(HSPs)mRNA水平。结果表明：高温应激后,血清GLU、AST含量有增加趋势,相应的血清ACTH、COR、T3、T4等激素含量也呈现增加,血清C3、C4、GLB、 CHOL、TG、Insulin等指标有降低趋势,并在高温应激后增加了肝脏MDA浓度,诱导肝脏的HSP60、HSP70、HSP90β基因表达,降低了肝脏的ASAFR、SOD浓度,并且高温应激影响了肝脏组织超微结构。这表明肝脏ASFER、SOD、MDA浓度,肝脏HSP70的基因表达与GLU、COR、T3、T4、Insulin、AST、C3、C4等血液指标存在一定的相关性,在高温应激过程中发挥了一定的作用,但具体作用机制还有待进一步的研究。因此,高温应激可以导致团头鲂的生理机能变化,提高肝脏应激蛋白HSP60、 HSP70、HSP90β的基因表达水平,影响团头鲂的的非特异免疫力。3高温应激后恢复对团头鲂血清生化、免疫与应激蛋白基因表达的影响实验选取规格基本一致的健康团头鲂90尾,随机分成6个平行组,每个平行组15尾鱼。鱼体驯化15d后,进行32℃高温应激1d后恢复2d,再32℃高温应激1d后进行鱼体恢复试验12d,测定血液生理生化及肝脏抗氧化及应激蛋白HSP70基因表达等变化。结果表明：第一次32℃高温应激后恢复2d、TG、ALB、C3、ALP、ACTH、 Insulin、T3、T4及肝脏ASFER、SOD、MDA等指标已基本恢复到了应激前水平,但是AST、CHOL、TP、GLB、C4、GLU、COR等的水平未曾得到恢复。在第二次32℃高温应激后恢复5d GLU、AST、TG、GLB、ALB、CHO、LTP、C3、C4、ALP、ACTH、 Insulin等血液指标及肝脏ASFER、SOD、MDA等指标已基本恢复到了应激前水平,只有COR、T3、T4等的水平未恢复；在第二次32℃高温应激后恢复12d、GLU、AST、 TG、GLB、TP、C3、C4、ALP、ACTH、Insulin、T3等血液指标及肝脏ASFER、SOD、MDA等指标已基本恢复到了应激前水平,仍有ALB、CHOL、COR、T4等的水平未恢复。因此,高温应激可以引起团头鲂的生理机能变化,提高肝脏应激蛋白HSP60、HSP70、HSP90β的基因表达水平；在应激后的恢复期,大多血液生理生化指标及肝脏抗氧化指标、HSPs在应激后恢复5d可恢复到应激前水平,只有皮质醇、T4激素一直在增加,这可能显示了皮质醇、T4激素对团头鲂高温应激有着很重要的影响。4大黄蒽醌提取物与大黄素对团头鲂抗高温应激与抗病原菌感染的影响将团头鲂随机分成3组,第1组为对照组,投喂基础日粮,另外2组为试验组,投喂基础日粮中分别添加0.1%大黄蒽醌提取物、60mg/kg大黄素。连续投喂8周后,对鱼体进行34℃高温应激12h,测定应激前后血液生理生化及肝脏抗氧化及应激蛋白HSP70基因表达等变化。结果表明：与对照组相比,应激前添加0.1%大黄蒽醌提取物和60mg/kg大黄素显著地增加了血清溶菌酶活性、超氧化物歧化酶活性和应激蛋白HSP70基因表达水平,显著降低了血清谷丙转氨酶活性。高温12h应激后,与对照组相比,0.1%大黄蒽醌提取物显著增加了应激后6h血清溶菌酶、总蛋白和甘油三酯,应激2h后碱性磷酸酶活性；显著增加了应激后2h、6h肝脏超氧化物歧化酶和应激2h后HSP70基因表达水平；显著降低了应激后2h、12h皮质醇、谷丙转氨酶活性,应激12h谷草转氨酶活性,应激2h后葡萄糖浓度,应激2h、6h肝脏丙二醛；并且60mg/kg大黄素显著增加了应激后6h血清甘油三酯、肝脏过氧化氢酶活性,应激2h、6h、12h后肝脏超氧化物歧化酶,应激2h、6h后HSP70基因表达水平；显著降低应激后2h、6h、12h皮质醇,应激后12h谷草转氨酶活性,应激后6h葡萄糖浓度。应激前后各组鱼的攻毒试验表明：添加0.1%大黄蒽醌提取物和60mg/kg大黄素死亡率分别为83.33%、80.00%,其中对照组死亡率最高达到100%。因此添加0.1%大黄蒽醌提取物和60mg/kg大黄素提高了机体抗高温应激能力,并对病原菌感染起一定的保护作用。5大黄蒽醌提取物与大黄素对团头鲂生长及抗高密度应激的影响将团头鲂随机分成3组,第1组为对照组,投喂基础日粮,另外2组为试验组,投喂基础日粮中分别添加0.1%大黄蒽醌提取物、60mg/kg大黄素。连续投喂8周后,对鱼体进行高密度应激24h,测定应激前后血液生理生化及肝脏抗氧化及应激蛋白HSP70基因表达及生长等变化。结果表明：与对照组相比,应激前添加0.1%大黄蒽醌提取物和60mg/kg大黄素显著增加了增重率、特定增长率,血清溶菌酶活性、肝脏超氧化物歧化酶活性和应激蛋白HSP70基因表达水平,显著降低了饵料系数,血清皮质醇、谷丙转氨酶活性。高温24h应激后,与对照组相比,0.1%大黄蒽醌提取物显著增加了应激后6h血清碱性磷酸酶、肝脏应激12h、24h超氧化物歧化酶活性和应激蛋白HSP70基因表达水平,显著降低了应激后12h、24h皮质醇,应激后12h血液谷草转氨酶、谷丙转氨酶活性和血糖浓度；并且60mg/kg大黄素显著增加了应激后12h血清溶菌酶,应激后12、24h肝脏过氧化氢酶活性和HSP70基因表达水平；显著降低应激后12h、24h皮质醇、谷丙转氨酶活性及应激后12h谷草转氨酶活性。因此,添加0.1%大黄蒽醌提取物和60mg/kg大黄素提高了机体抗高密度应激能力,促进了鱼体的生长。6大黄蒽醌提取物与大黄素对团头鲂抗嗜水气单胞菌感染的影响将团头鲂随机分成3组,第1组为对照组,投喂基础日粮,另外2组为试验组,投喂基础日粮中分别添加0.1%大黄蒽醌提取物、60mg/kg大黄素。连续投喂8周后,对鱼体进行病原菌感染试验5d,测定感染前后血液生理生化及肝脏抗氧化及应激蛋白HSP70基因表达等变化。结果表明：与对照组相比,攻毒前添加0.1%大黄蒽醌提取物和60mg/kg大黄素显著增加了血清溶菌酶活性,总蛋白浓度,肝脏应激蛋白HSP70基因表达水平；0.1%大黄蒽醌提取物显著增加了超氧化物歧化酶活性,降低了血清碱性磷酸酶活性,60mg/kg大黄素显著降低了血清皮质醇。病原菌感染后,与对照组相比,0.1%大黄蒽醌提取物显著增加了感染后24h、48h血清碱性磷酸酶,感染后6h、12h血清总蛋白浓度,感染后12h血清胆固醇浓度、肝脏过氧化氢酶活性,感染后6h肝脏HSP70基因表达水平；显著降低了感染后6h血液皮质醇浓度,感染后12h血液谷草转氨酶活性,感染后6h、12h血液谷丙转氨酶活性及肝脏丙二醛浓度。60mg/kg大黄素著增加了感染后6h、48h血清溶菌酶活性,感染后24h、48h血清碱性磷酸酶,感染后6h、12h血清总蛋白浓度,感染后24h血清胆固醇浓度。显著降低了感染后12h血液谷草转氨酶活性,感染后6h、12h血液谷丙转氨酶活性及肝脏丙二醛浓度,感染后24h血糖浓度。各组鱼的攻毒试验表明：添加0.1%大黄蒽醌提取物和60mg/kg大黄素死亡率分别为83.33%、80.00%,其中对照组死亡率最高达到100%。因此,添加0.1%大黄蒽醌提取物和60mg/kg大黄素对嗜水气单胞菌感染起一定的保护作用。