产酶溶杆菌OH 11(Lysobbacter enzymogenes)是一种由辣椒根际土壤中分离得到的农业革兰氏阴性细菌,该菌能产生多种胞外酶,包括几丁质酶、蛋白酶、纤维素酶、β-1,3-葡聚糖酶等,能降解不同植物病原菌的细胞壁组分,是一种具有广阔应用前景的生防细菌。同时,该菌也能合成并外泌一种广谱抗真菌和卵菌次生代谢产物HSAF,通过调节丝状真菌鞘脂类化合物的生物合成,从而抑制病原真菌的生长。近年来,相关研究表明产酶溶杆菌还能够依赖菌体的Ⅳ型菌毛(T4P)吸附在真菌菌丝上,使菌丝消解从而产生生防效果,因此由T4P介导的蹭行运动也被作为产酶溶杆菌生防能力的一个重要指标。本文以产酶溶杆菌OH11为研究对象,探究菌体产生蹭行运动的机理。在产酶溶杆菌中,Clp作为一个全局性调控因子,能调控几丁质酶、次级代谢产物的生物合成以及菌体的蹭行运动,但其调控蹭行运动的机制未知。本文首先通过体外凝胶阻滞电泳实验(EMSA),发现Clp能直接结合在Ⅳ型菌毛合成蛋白PilA编码基因的启动子区。进一步通过启动子截短和EMSA技术,将Clp的结合区域定位到一段41 bp的DNA序列。通过生物信息学分析,在这一段41 bp的DNA序列中发现了Clp的潜在结合位点GTG**********CAC。通过基因定量表达、组成型启动子替换和Western blot杂交等遗传和生化研究,发现这段41 bp的序列的确为Clp的结合位点。以在pilA启动子区发现的Clp结合位点为诱饵,在OH11的全基因组范围内进行扫描,发现222个基因启动子区含有类似的结合位点。从中发现负责Ⅳ型菌毛在周质空间组装的合成基因簇PilMNOPQ的启动子区也存在Clp的结合位点。通过体外EMSA和体内基因定量表达分析,发现Clp可以直接结合在pilM的启动子区,进而正向控制该基因簇的转录。这些研究表明,在产酶溶杆菌OH11中Clp通过一种双重转录调控机制来控制由Ⅳ型菌毛介导的细胞蹭行运动,并且这种调控方式在多种溶杆菌种中相对保守。本实验室前期实验发现,在产酶溶杆菌OH11存在26个与c-di-GMP(环二鸟甘酸)合成代谢相关的蛋白,其中含有退化的GGDEF结构域的Le2996(lctM)过表达后丧失了蹭行运动,于是本文对这种现象背后的分子机制进行了研究。生物信息学分析表明,LctM的N端整合在细菌内膜,含有6次跨膜区;其C端定位在细胞质内,含有一个退化的GGDEF结构域,表明该蛋白是一个没有合成c-di-GMP功能的蛋白。为了探索LctM调控TM的机制,本研究以LctM为诱饵,对19个能控制IV型菌毛合成的Pil蛋白进行了一对一的细菌双杂交筛选,发现跨内膜蛋白PilO能与LctM发生特异性互作。本文初步揭示了全局性调控因子Clp和含有退化的GGDEF结构域的LctM调控蹭行运动的机理,为通过遗传改良提升TM能力,更好地定殖在植物或真菌菌丝上发挥生防效果奠定了基础。