一、研究背景最新统计资料显示,在欧美发达国家和我国城市中,肺癌已位居男性恶性肿瘤发病率、死亡率的首位,女性恶性肿瘤发病率的第二位,死亡率的第一位。目前肺癌的发病率正呈不断上升的趋势,其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)约占全部肺癌的80%以上。肺癌的分子流行病学研究发现,烟草或工业废气等环境致癌物质,可作为支气管和肺泡上皮细胞的启动因子,使原癌基因如k-ras激活(称为癌基因),以及抑癌基因如p53和RB1失活,引起支气管和肺泡上皮的增殖异常,细胞增殖和凋亡平衡紊乱,最终导致细胞生长调节失控而形成肿瘤。细胞增殖异常是导致肺癌发生的重要原因,但其确切机制目前仍未完全阐明。因此,进一步发现肺癌细胞增殖的相关调控因子,将有助于阐明肺癌发生和发展的分子机制。EGFL7(又名VE-statin,即类表皮生长因子域-7)是V.Mattot在2006年发现的一个内皮特异性基因,它在胚胎发育过程中的内皮细胞及内皮祖细胞中表达,是血管管腔发育过程中的关键因素,其表达降低可直接引起血管管腔的发育障碍。Sharon D等研究发现EGFL7在血管内皮细胞中的表达随着缺氧条件下诱导的血管生成紧接着很快上调,但这种增强的现象在更多的较成熟的肿瘤血管中并不持续存在,这表明其仅在血管生成的早期阶段发挥作用。另外,Parker LH等研究发现,EGFL7在许多人类肿瘤中的血管内皮细胞内高表达,包括肺腺癌、肾透明细胞癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌、骨肉瘤、软骨肉瘤等,但在同一病人的非肿瘤组织中却几乎检测不到Egfl7 mRNA。因此,已有的研究表明,EGFL7对胚胎和肿瘤组织的血管生成过程可能有促进作用,但对于肺癌细胞的增殖情况有何影响却未见明确报道。microRNA(miRNA)是长度为18-24 nt的单链、非编码核苷酸分子,具有高度的进化保守性,与其他蛋白质一起组成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC)。当RISC蛋白复合体与靶基因的信使RNA (mRNA)结合后,RISC开始切割mRNA或是阻断mRNA的翻译,从而引起靶mRNA的降解或者翻译抑制。它广泛参与动植物生长发育、细胞分化、增殖与凋亡、激素分泌及肿瘤形成等多种重要生物过程。生物信息学预测的结果显示每个miRNA可以调控成千数百个靶基因,这些miRNA几乎对每一条遗传通路都具有潜在的影响,它们调控着不同的生物过程。miRNA突变和异常表达与各种人体肿瘤的发生、发展关系密切,miRNA可作为癌基因或抑癌基因而起作用。miRNA参与多种重要肿瘤相关基因(如miR-17/20与IL-8,miR-17-92与p21,miR-181a与Bcl-2,miR-146a与EGFR,miR-182与RGS17,miR-199A2/214与Twist1)的表达调控,它们分别在乳腺癌、白血病、胶质瘤、胰腺癌、肺癌、卵巢癌等发生和发展过程中起重要作用。已有研究显示包括miR-126在内的多种miRNA参与了肺发育和肺癌的发病过程,小鼠和人肺发育过程中的不同发育时期miR-126等miRNA表达水平不同,miR-126表达水平随着肺组织的发育成熟逐渐增高。为进一步分析miR-126对Egfl7基因表达有何调节作用,我们通过生物信息学软件(miRanda和Targetscan软件)预测发现miR-126位于EGFL7基因3’-UTR的内含子6和7内,miR-126能与EGFL7mRNA的3’-UTR部分配对,从而影响其转录后的翻译过程。基于以上分析,本实验设想通过构建一种靶向于EGFL7的miR-126过表达质粒并将其转染进入培养中的非小细胞肺癌细胞株A549细胞,经G418筛选建立稳定转染株,然后检测miR-126过表达对其靶基因EGFL7表达的影响,通过平板克隆增殖实验、软琼脂克隆增殖实验、细胞计数法绘制生长曲线实验、流式细胞术等体外实验以及裸鼠肺癌体内移植模型的建立等体内实验来检测转染前后非小细胞肺癌细胞的增殖情况的改变情况。二、研究目的1、检测miR-126对EGFL7的靶向作用。2、通过体外实验检测miR-126过表达对A549细胞的增殖情况影响。3、通过体内实验检测miR-126过表达对A549细胞成瘤情况的影响。三、实验方法1、构建miR-126过表达质粒,并将其和空质粒分别转染至A549细胞,经G418筛选建立两组稳定转染株。2、流式细胞术检测基因转染效率。3、光学显微镜下观察转染前后A549细胞和A549/miR-126细胞形态学差异。4、流式细胞术、Western blot和实时荧光定量PCR等方法检测转染前后三组细胞中EGFL7及其mRNA的表达情况。5、细胞计数实验、细胞增殖实验(包括平板克隆实验和软琼脂克隆实验)等方法观察过表达质粒对于A549细胞体外增殖情况的影响。6、采用流式细胞术对转染前后三组细胞进行细胞周期检测,分析三组细胞之间细胞周期的差异。7、皮下注射转染前后的三组细胞,建立裸鼠肺癌体内移植模型,观察过表达质粒对于转染前后细胞成瘤情况的影响,包括移植瘤生长曲线、瘤体体积和重量之间的比较。8、分别取三组移植瘤组织制作冰冻切片,进行免疫组化染色,比较转染前后三组不同移植瘤组织内EGFL7表达变化情况。9、统计学分析实验结果均经SPSS13.0软件统计。各实验至少独立重复3次,重复性好。所选图表为3次重复实验的结果之一。数据以平均数±标准差表示,组间比较采用方差分析。以P<0.05表示有统计学意义。四、结果1、成功建立了两株稳定转染细胞株,包括空质粒转染株(A549/mock组)和过表达质粒转染株(A549/miR-126组)。2、经流式细胞仪检测细胞转染效率发现,A549/mock、A549/miR-126两组细胞转染率均达90%。3、光镜下观察发现,A549细胞与A549/mock细胞呈多边形,而A549/miR-126细胞则呈梭形,即转染了过表达质粒的细胞相对于其他组细胞形状变得较狭长。4、实时荧光定量PCR检测转染前后三组细胞内miR-126和EGFL7mRNA量发现,相对于A549组细胞和A549/mock组细胞,A549/miR-126组细胞内miR-126和EGFL7mRNA含量较高。5、采用Western blot和流式细胞术检测转染前后三组细胞内EGFL7蛋白含量发现,与A549组细胞和A549/mock组细胞任一组进行比较,A549/miR-126组细胞内EGFL7含量均较高。6、对培养中的三组细胞,采用细胞计数法绘制贴壁细胞生长曲线,结果显示,相对于A549组细胞与A549/mock组细胞的任一组,A549/miR-126组细胞的生长速度明显减慢。7、三组细胞的平板克隆实验结果显示,与A549组细胞和A549/mock组细胞任一组进行比较,A549/miR-126组细胞的增殖克隆数明显较少。8、通过对三组细胞进行软琼脂克隆实验,我们发现,与A549组细胞和A549/mock组细胞任一组进行比较,A549/miR-126组细胞增殖的克隆数明显较少。9、经流式细胞仪检测三组细胞的细胞周期分析发现,与A549组和A549/mock组细胞任一组比较,A549/miR-126组的细胞S期增殖指数较低,表明miR-126过表达后,细胞的S期合成显著减少(F=60.150,P<0.001)。10、裸鼠肿瘤移植模型显示,与A549组和A549/mock组任一组进行比较,A549/miR-126组的瘤体体积明显较小、瘤体重量较轻、生长速度较慢。11、对三组瘤组织制作冰冻切片并做免疫组化,结果显示,与A549组和A549/mock组任一组进行比较,A549/miR-126组的瘤组织中EGFL7含量较高。五、结论1、miR-126正向调控EGFL7在mRNA和蛋白水平的表达。2、miR-126过表达可抑制A549细胞的体外增殖。3、miR-126过表达可抑制A549细胞的体内成瘤。