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目的： 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H.pylori）是一种主要定植于胃粘膜表面的革兰氏阴性螺旋状杆菌，主要通过粪-口途径在人与人之间传播。幽门螺杆菌长期慢性感染胃粘膜上皮细胞是胃癌发生发展的主要危险因素。幽门螺杆菌感染引起胃上皮细胞DNA双链断裂损伤和基因突变是胃癌早期的重要分子机制。以往研究表明H.pylori分泌的多种细菌毒力因子可以引起胃上皮细胞的DNA损伤，包括细胞毒素相关基因A(cytotoxin associated gene A，CagA)、细胞空泡毒素A(vacuolating cytotoxin A，VacA)等。在哺乳动物体内，DNA双链断裂损伤修复主要通过两种途径来完成，即精确的同源重组(homologous recombination，HR)修复和不精确的非同源末端连接(non-homologous end join，NHEJ)修复。以往在胃癌细胞系中的研究表明，H.pylori可以降低多种DNA损伤修复基因的表达，使宿主细胞选择更容易出错的NHEJ修复，从而引起基因组不稳定性增加，增加了癌症发生的风险。国内外关于幽门螺杆菌感染对HR修复的影响尚无确定研究，关于其重要的毒力因子VacA对HR修复的影响也尚无定论。本研究拟通过H.pylori标准菌株Hp P12和其vacA基因敲除株Hp P12ΔvacA感染胃上皮GES-1细胞系和人胚肾HEK-293(DR-GFP)细胞系，从而检测H.pylori对HR修复的影响，以及VacA毒力因子对HR修复的调控作用。 方法： 1.用Hp P12标准株以MOI=25、50、100和200分别感染GES-1细胞12h，western blot方法检测细胞内CagA的表达，以此来评估不同MOI对感染效果的影响。 2.用Hp P12标准株以MOI=100感染GES-1细胞6h、12h、24h，western blot方法检测HR修复关键蛋白(MRE11、CtIP)和CagA的表达，评估不同感染时间对HR修复及感染效果的影响。 3.用Hp P12标准株及其ΔcagPAI、ΔcagA、ΔvacA、ΔcagL和ΔcagE基因敲除株以MOI=100分别感染GES-1细胞12h，western blot方法检测DNA损伤标记蛋白γH2AX、HR修复关键蛋白(CtIP、pCtIP、pMRE11、Rad51)和磷酸化细胞周期检测点激酶2(pChk2)的表达，分析幽门螺杆菌各毒力因子对GES-1细胞DNA损伤和HR修复的影响。 4.用Hp P12标准株和Hp P12ΔvacA基因敲除株以MOI=100分别感染GES-1细胞12h，免疫荧光方法检测DNA损伤标记蛋白γH2AX和HR修复关键蛋白CtIP和Rad51的募集情况。 5.用Hp P12标准株和Hp P12ΔvacA基因敲除株以MOI=50感染人胚肾HEK-293(DR-GFP)细胞6h，流式细胞仪检测细胞内GFP阳性细胞数目比例，从而检测HR修复的效率。 结果： 1.Hp P12感染GES-1细胞后可检测到细胞内CagA表达较未感染组上调，HR修复关键蛋白（MRE11、CtIP）表达较未感染组上调，MOI=50，感染6h时差异有统计学意义(P＜0.01)。 2.Hp P12标准株及其ΔcagPAI、ΔcagA、ΔvacA、ΔcagL和ΔcagE基因敲除株感染GES-1细胞后，HR修复上游调控蛋白(pCtIP、pMRE11)和细胞周期检测点激酶2(pChk2)的表达均较未感染组上调(P＜0.01);其中Hp P12ΔvacA感染组较其他菌株感染组下调(P＜0.05)。对于HR修复核心蛋白Rad51的表达，Hp P12标准株感染组较未感染组上调(P＜0.01);ΔcagPAI、ΔcagA、ΔvacA、ΔcagE基因敲除株感染组均较P12标准株感染组下调(P＜0.01)，其中ΔvacA基因敲除株感染组较其他菌株感染组下调(P＜0.05);ΔcagL基因敲除株感染组较未感染组上调(P＜0.01)，而较P12标准株感染组无明显差异（P=0.6561），需要进一步采用其他方法验证。 3.Hp P12标准株和Hp P12ΔvacA基因敲除株感染GES-1细胞后，DNA损伤标记蛋白γH2AX的表达和募集，在Hp P12感染组较未感染组上调(P＜0.05)，在Hp P12ΔvacA感染组较Hp P12感染组下调(P＜0.05)。同样，HR修复关键蛋白（Rad51、pMRE11、CtIP和pCtIP）的表达和募集，在Hp P12感染组较未感染组上调(P＜0.05)，在Hp P12ΔvacA感染细胞中较Hp P12感染组下调(P＜0.05)。 4.进一步采用Hp P12标准株和Hp P12ΔvacA基因敲除株感染I-SceI质粒转染的HEK-293(DR-GFP)细胞进行验证，发现Hp P12感染组GFP阳性细胞数较未感染组下调，而Hp P12ΔvacA感染组下调更加明显(P＜0.05)。 结论： 1.Hp P12标准株感染胃上皮GES-1细胞后引起DNA双链断裂损伤，并上调HR修复关键蛋白和pChk2的表达，促进HR修复关键蛋白在DNA损伤部位的募集，表明Hp P12感染胃上皮GES-1细胞过程中促进了HR修复，其中VacA毒力因子起到促进HR修复的重要作用。 2.在不同细胞系中幽门螺杆菌对HR修复的作用机制不同。