论文部分内容阅读
癌症是严重影响人类生活质量的疾病。统计结果表明，1970到2005年，我国肺癌死亡率逐年上升。非小细胞肺癌(Non-small-cell lung cancer)包括鳞癌、腺癌、大细胞癌，其生长分裂较慢，扩散转移较晚，对传统化疗的敏感性较差，约占肺癌总数的80-85%。溶瘤腺病毒作为靶向肿瘤基因-病毒疗法(CTGVT)中的常用载体现已进入临床试验阶段，对其的改造主要集中疗效与安全性两方面。Apoptin与IL-24都能特异性诱导肿瘤细胞发生凋亡，而且这种效应是p53非依赖的。基于hTERT启动子在人肿瘤细胞中的高活性，我们利用其启动病毒E1A基因的表达，缺失E1A区与Rb结合相关的24bp，并将Apoptin与IL-24表达框插入该E1B55K敲除的腺病毒载体中。实验结果表明，重组病毒对多种肿瘤细胞有杀伤作用，并能特异性靶向肺癌细胞而对正常肺上皮细胞或肺癌癌旁细胞的影响较小。病毒对肿瘤细胞的杀伤具有时间与剂量依赖性。低MOI时，较空载而言，外源表达Apoptin与IL-24的病毒杀伤肿瘤细胞的效果并不明显，但高MOI时(MOI>10)，携带基因的病毒对肿瘤细胞的杀伤显著高于空载病毒(p<0.001)。重组病毒在肿瘤细胞中的复制能力显著高于正常细胞中(p<0.005)，外源表达Apoptin与IL-24的病毒复制能力较空载病毒差。携带IL-24的病毒具有较好的杀伤效果及较高的复制能力，携带Apoptin的病毒其杀伤效果不理想，这可能是由于基因效应或插入位点降低了病毒复制能力造成的。对病毒杀伤A549细胞的机制研究结果表明，重组病毒能诱导A549发生凋亡，而且主要是通过线粒体途径进行的。除此之外，重组病毒还有可能通过诱导肿瘤细胞G2/M细胞周期停滞以及细胞自噬而杀伤肿瘤细胞。虽然双基因携带的病毒杀伤能力差，但是Apoptin与IL-24单基因病毒的联合使用获得较好的杀伤效果，这暗示Apoptin与IL-24之间并无拮抗作用，也暗示了将Apoptin与IL-24基因以连接子连接，构建成融合基因后利用腺病毒载体进行表达的可行性，但是连接子的选择、基因的前后顺序、基因表达框的插入位点等问题仍待考察。作为2A多肽的一员，P2A具有剪切效率高、残留碱基对蛋白功能无影响的优势。