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背景:结直肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一,病死率高,预后差。众多研究表明,肿瘤的发生与演变是遗传学(genetics)与表观遗传学(epigenetics)共同作用的结果。结直肠癌的发生是一个多因素、多步骤的过程。随着表观遗传学研究的深入,现已发现DNA甲基化与结直肠癌的发生和发展密切相关。因此,检测结直肠癌相关基因的甲基化状态,对结直肠癌的诊断、治疗、预后判断等方面具有重要意义。目的:本研究在建立了基于HRM的MS-HRM(Methylation-sensitive high-resolution meilting)即甲基化敏感性高分辨率熔解曲线方法的基础上,检测了结直肠癌相关基因MGMT、CDH13、hMLH1、DAPK和SEPT9的甲基化状态,并对多基因甲基化与结直肠癌的关系进行了初步探讨。方法:1、构建基于HRM的MS-HRM方法:结合LightCycler 480精确的温控能力和高密度数据采集能力,构建可划分样本甲基化程度的标准曲线,建立检测各基因甲基化状态的最佳反应体系和反应条件。2、检测结直肠癌相关基因的甲基化状态:以构建的MS-HRM方法为平台,对结直肠癌相关基因MGMT、CDH13、hMLH1、DAPK和SEPT9在结直肠癌患者的癌组织、正常组织和血清中的甲基化状态进行高通量检测。3、基因启动子甲基化与结直肠癌关系的分析:比较基因启动子甲基化在结直肠癌组织和正常组织中的表达差异,分析基因启动子甲基化与结直肠癌临床病理特征之间的相关性,并探讨多基因甲基化联合检测对结直肠癌的诊断意义。结果:1、建立了检测各基因甲基化的MS-HRM法的最佳反应体系和反应条件,可以实现各基因甲基化状态的高通量定量检测。2、MGMT基因在结直肠癌组织的甲基化率明显高于正常组织(P<0.05),其甲基化水平与结直肠癌患者的年龄、性别、肿瘤部位之间无明显的相关性(P>0.05),但与肿瘤病理分级和分化程度有关(P<0.05)。CDH13、hMLH1和DAPK在结直肠癌组织的甲基化率明显高于正常组织(P<0.05),而SEPT9甲基化水平在结直肠癌组织和正常组织中无明显差异(P>0.05);结直肠癌组织中SEPT9、CDH13、hMLH1和DAPK的甲基化水平与患者的年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤病理分级和分化程度之间均无明显的相关性(P>0.05)。3、MGMT、CDH13、hMLH1和DAPK多基因甲基化联合检测对结直肠癌诊断的灵敏度和特异度分别是78.8%和90.9%,ROC曲线下面积(AUC)为0.848,与0.5相比差异有统计学意义。结论:1、本实验建立了检测各基因甲基化的MS-HRM法,从技术上和实用上证实了MS-HRM检测多基因甲基化的优势和可行性。2、MGMT基因甲基化水平与结直肠癌的病理分级和分化程度的差异有统计学意义,预示其与肿瘤的进展有关,可成为评估结直肠癌发展和恶性程度的分子指标。3、MGMT、CDH13、hMLH1和DAPK的多基因甲基化联合检测有较好的诊断性能,可作为结直肠癌诊断的候选基因和参考方案之一。