论文部分内容阅读
目的：以逆转录病毒为载体，将外源性IL-18基因转染到大鼠胶质瘤细胞9L中，建立能够持续分泌IL-18的9L/IL-18细胞；观察外源性IL-18对9L细胞体内、外生物学性状的影响；探讨IL-18对9L细胞的抗肿瘤作用机制，为IL-18应用于胶质瘤的免疫治疗提供实验和理论依据。方法：1分别用PA317/IL-18和PA317/LXSN细胞培养上清转染大鼠胶质瘤细胞9L，经G418筛选后获得稳定转染外源性IL-18基因的细胞9L/IL-18和转染空载体的细胞9L/LXSN。2采用RT-PCR的方法检测9L/IL-18、9L/LXSN及9L细胞IL-18mRNA表达；免疫组织化学染色法检测三种细胞中IL-18蛋白表达；ELISA法检测三种细胞分泌IL-18的水平及三种细胞培养上清诱导大鼠脾细胞分泌IFN-γ的水平。3采用MTT法检测9L/IL-18、9L/LXSN及9L细胞的体外增殖能力。4采用流式细胞分析技术检测9L/IL-18、9L/LXSN和9L细胞表面MHCⅠ类分子、MHCⅡ类分子、CD80和CD86的表达，以及三种细胞的细胞周期和凋亡情况。5采用立体定向技术，分别将9L/IL-18、9L/LXSN及9L细胞接种到F344大鼠颅内，建立荷瘤实验动物模型，比较三组细胞在大鼠体内的成瘤性。6采用流式细胞分析技术检测肿瘤组织中MHCⅠ类分子、MHCⅡ类分子、CD80和CD86的表达及大鼠外周血中CD4+T细胞和CD8+T细胞的百分比，计算CD4+/CD8+T细胞比值。7采用ELISA法检测大鼠外周血中TGF-β的水平。8采用TUNEL法检测肿瘤组织细胞的凋亡情况，计算各组肿瘤细胞的凋亡百分率。9采用RT-PCR法检测肿瘤组织中IL-18、Bax、Bcl-2、Fgf2mRNA表达；Westen Blot法检测肿瘤组织中Bax和Bcl-2蛋白表达。10经HE染色用显微镜观察肿瘤组织内血管的形成情况。结果：1经PA317/IL-18细胞培养上清转染和G418筛选后，9L/IL-18细胞能够稳定表达IL-18mRNA及IL-18蛋白；9L/IL-18细胞培养上清中IL-18的含量为112.00±4.30ng/L，明显高于9L/LXSN和9L组（p<0.05）；在ConA作用下，9L/IL-18细胞培养上清可诱导大鼠脾细胞分泌IFN-γ（28.43±1.81pg/ml），且其水平明显高于9L/LXSN（12.56±0.85pg/ml）和9L细胞（10.43±0.57pg/ml），差异有统计学意义（p<0.05）。2显微镜下观察，9L/IL-18细胞与9L/LXSN、9L细胞形态无明显差异，但是细胞增殖实验结果显示，9L/IL-18细胞在体外的增殖能力降低，与9L/LXSN和9L细胞相比，差异有统计学意义（p<0.05），9L/LXSN与9L细胞的体外增殖能力无明显差异（p>0.05）。3流式细胞分析结果显示，9L/IL-18、9L/LXSN和9L细胞表面MHCⅠ类分子、MHCⅡ类分子、CD80和CD86的表达无显著差异（p>0.05）；9L/IL-18细胞G0/G1期、G2/M期和S期细胞比例分别为59.70±2.02%、16.80±2.04%、23.70±3.12%；9L/LXSN细胞G0/G1期、G2/M期和S期细胞比例分别为49.30±2.07%、19.10±1.94%、31.60±2.10%；9L细胞G0/G1期、G2/M期和S期细胞比例分别为35.70±2.33%、15.80±2.10%、48.50±2.63%，前者与后两组相比，G0/G1期细胞增加，S期细胞减少，差异有统计学意义（p<0.05），后两者之间差异无统计学意义（p>0.05）。49L/IL-18、9L/LXSN和9L细胞在大鼠颅内的成瘤率均为100%，但接种9L/IL-18细胞组大鼠的平均生存期（22.75±1.11天）长于接种9L/LXSN和9L组（分别为15.00±0.91天和16.50±1.04天）（p<0.05）。5接种9L/IL-18细胞组大鼠肿瘤组织中MHCⅠ类分子、CD80和CD86表达率分别为（67.51±1.40%、12.51±1.57%、6.95±0.56%），均高于接种9L/LXSN细胞组（60.31±1.01%、6.77±0.86%、2.93±0.29%）和9L细胞组（61.08±0.46%、7.04±1.24%、3.06±0.28%），差异均有统计学意义（p<0.05），后两者间无统计学差异（p>0.05）；三组间MHCⅡ类分子表达分别为3.76±0.26%、3.73±0.55%、4.87±0.67%无显著差异（p>0.05）。6接种9L/IL-18细胞组大鼠外周血中CD8+T细胞百分比为32.30±2.22%，与接种9L/LXSN和9L细胞组（22.02±0.67%、22.34±0.76%）相比，显著增高（p<0.05），CD4+T细胞百分比及CD4+/CD8+T细胞比值显著降低（p<0.05）。7ELISA法检测结果显示，接种9L/IL-18细胞组大鼠外周血TGF-β水平（111.55±5.93ng/L）显著低于接种9L/LXSN（127.89±4.01ng/L）和9L细胞组（133.42±3.68ng/L）（p<0.05）。8接种9L/IL-18细胞组大鼠肿瘤组织内可见大量凋亡细胞，凋亡率为22.20±1.02%，而接种9L/LXSN及9L细胞组仅见少量凋亡细胞，凋亡率分别为5.70±0.32%、6.40±0.51%，接种9L/IL-18细胞组大鼠肿瘤细胞的凋亡率明显高于其他两组（p<0.05）。9接种9L/IL-18细胞组大鼠肿瘤组织内IL-18mRNA表达阳性，而接种9L/LXSN和9L组IL-18mRNA表达呈阴性；接种9L/IL-18细胞组大鼠肿瘤组织内Bax表达明显升高，Bcl-2、Fgf2表达降低。10接种9L/IL-18细胞组大鼠肿瘤组织内未见或少见新生血管的生成，而9L/LXSN和9L组肿瘤组织内新生血管显著增多。结论：1在体外，转染外源性IL-18基因对9L细胞形态及细胞表面CD80、CD86、MHCⅠ、Ⅱ类分子表达及细胞凋亡无显著影响；但抑制细胞增殖，并使G0/G1期细胞增加，S期细胞减少。2在体内，IL-18可通过上调肿瘤细胞表面CD80、CD86、MHCⅠ类分子水平，增强肿瘤细胞抗原性及抗原递呈能力；可降低荷瘤鼠外周血TGF-β水平，提高CD8+T细胞比例，改善大鼠体内免疫抑制状态，提高免疫功能。3IL-18可能通过增加荷瘤鼠肿瘤组织Bax的表达，降低Bcl-2的表达，促进肿瘤细胞凋亡；通过降低Fgf2的表达抑制肿瘤组织新生血管的生成，从而发挥抗肿瘤作用。