研究背景:肺癌是我国发病率和死亡率均排第一的恶性肿瘤。从病理组织学上分类,肺癌主要可分为小细胞肺癌(Small cell lung cancer,SCLC)和非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)。根据最新分期标准所采纳的数据,其中NSCLC患者占据的比例高达92%。癌症发生发展伴随多种信号通路异常。Notch信号通路通过相邻细胞之间的相互作用调节细胞、组织、器官的分化和发育。Notch信号通路平衡细胞增殖、分化、凋亡的作用,某种程度上表明该通路可能与肿瘤细胞的异常调控相关,因而针对Notch信号通路的靶向性药物成为临床治疗和研究的热点之一,尤其是与肺癌预后呈显著负相关的Notch3受体。表观遗传学是近年来热门研究方向,其中DNA甲基化是最早被广泛描述且研究最深入的表观遗传学部分。抑癌基因的高甲基化研究较多,而对促癌基因的低甲基化研究较少,因此寻找促癌基因的表观遗传学修饰剂是非常有意义的。我国的天然药物资源丰富,有望成为其重要物质来源。吴茱萸是我国中医临床常用中药,从中提取的重要生物碱类成分吴茱萸碱(Evodiamine,EVO),据报道有较好的抗肿瘤活性,可作为潜在的抗肿瘤药物。基于目前研究现状,本文将从体外细胞模型研究EVO对Notch通路的调控作用及机制,并通过小鼠肺癌预防模型从体内验证。研究目的:本研究我们主要考察了 EVO对Notch通路的调控作用及其作用机制。在实验中,我们采用两种NSCLC细胞系A549和H1299,从体外考察EVO对Notch通路关键蛋白的影响及其作用机制。采用人胚肺成纤维细胞(MRC-5)细胞系来检测EVO对正常细胞的毒性。在体内采用肺癌预防模型,即乌拉坦诱导FVB小鼠肺癌模型来进一步探索EVO在体内对NSCLC的预防作用及机制。研究方法:1.评价EVO对肺癌细胞活力的影响选用A549、H1299、H1975三种NSCLC细胞系以及正常人胚肺成纤维细胞MRC-5,根据MTT实验的实验步骤,检测EVO作用48h后对细胞活力的作用并计算IC50值,选取合适的细胞系及给药浓度作为体外研究模型。2.检测EVO对A549和H1299细胞增殖和细胞周期的影响经MTT法筛选出A549和H1299作为后续实验研究对象旧物作用时间为48h。EdU法检测EVO对两种细胞系增殖能力的影响;收细胞样品,PI标记流式细胞术检测EVO对两种细胞系周期的影响;提取细胞总蛋白,western blot实验检测周期相关的蛋白表达水平变化。3.考察EVO对A549和H1299恶性程度的影响肿瘤恶性程度可用肿瘤细胞迁移、浸润能力以及细胞干性来评价,EMT转化促进肿瘤细胞的浸润以及肿瘤的转移。划痕实验检测EVO对两种细胞系迁移能力的影响,琼脂糖克隆实验检测EVO对两种细胞系克隆形成的影响,流式细胞术检测细胞干性标志物CD44和CD133的表达。提取细胞蛋白样品,western blot检测EMT标志蛋白 E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 的蛋白表达水平。4.评价EVO对Notch信号通路关键蛋白的影响提取细胞蛋白样品和RNA,通过western blot实验和RT-PCR实验检测Notch信号通路中Notch关键蛋白表达水平和mRNA水平以及下游靶基因的mRNA水平。5.研究EVO调控Notch信号通路的机制提取细胞DNA样品,MSP实验验证EVO对两种细胞系中Notch3启动子区CpG岛的甲基化作用,甲基化质谱测序检测每个CG位点的甲基化程度,western blot检测EVO对DNA甲基转移酶(DNMTs)蛋白表达的影响,RT-PCR检测Notch3基因转录水平。6.小鼠肺癌模型的建立以及评价EVO的药效采用乌拉坦腹腔注射诱导肺癌模型,分别经EVO 0.5%CMC-Na、5 mg/kg、10 mg/kg灌胃至22周,考察EVO在肺癌形成和发展过程中的化学预防作用。统计动物体重变化、肺结节数目、脏器指数,western blot检测肺组织中Notch信号通路中关键蛋白的表达,HE染色检查肺病理改变,免疫组化检查肺组织Notch3蛋白的表达。7.统计学分析采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析,多组间均数比较采用One way ANOVA,p<0.05表示具有显著学差异。采用GraphPad 5.0数据分析软件作图,数据结果以Mean±SD 表示。研究结果:1.EVO显著抑制A549和H1299的细胞活力经EVO给药48h后,15μM和5 μM EVO对A549和H1299分别表现出显著的抑制作用。根据MTT检测结果,确定EVO给药浓度:在A549给药0,4,8,16 μM;H1299给药0,1,2,4μM,均小于对应的IC50值。2.EVO抑制A549和H1299细胞增殖能力,将细胞周期阻滞在G2/M期EDU实验结果显示,吴茱萸碱显著抑制A549和H1299细胞的增殖,抑制率达87.1%和77.4%。流式细胞实验结果显示EVO能够将两种细胞系周期阻滞在G2/M期,在A549细胞系上尤为明显。同时western blot结果表现为:G2/M检查点关键蛋白cyclinB1及其调节cdc2蛋白表达水平下降。3.EVO降低A549和H1299的恶性程度划痕实验表明EVO显著抑制两种细胞系的迁移能力,琼脂糖克隆实验表明EVO显著抑制肿瘤细胞克隆形成。流式细胞术结果表明吴茱萸碱降低肺癌细胞中的干细胞比例。western blot实验显示EVO上调了E-cadherin的蛋白表达,降低N-cadherin和Vimentin的蛋白表达,从而抑制了 EMT转化。4.EVO抑制Notch信号通路进展western blot结果表明经EVO给药之后,Notch受体如Notch1、Notch3、NICD蛋白表达均呈现出下调趋势,Notch3尤为明显,免疫荧光实验进一步验证了药物处理后Notch在胞膜上的表达水平下降;Notch配体如jagged1蛋白表达水平降低;S2剪切酶ADAM9,S3剪切酶y-secretase complex均有不同程度的下调。RT-PCR实验结果显示notch signaling下游靶基因如hes family、HER-2、Myc等基因mRNA水平也呈下调趋势。5.EVO促进Notch3甲基化表观遗传调控Notch信号通路MSP实验表明EVO增加了 Notch3 DNA启动子区域的甲基化水平,甲基化质谱测序结果显示在A549细胞系上有15个CG位点有不同程度的甲基化,其中有5个位点的甲基化程度是对照组的2倍以上,最大差异为4.25倍;在H1299细胞上有16个CG位点存在甲基化,其中有7个位点的甲基化程度是对照组的2倍以上,最大差异为6.7倍。Western blot结果显示EVO上调DNA甲基转移酶DNMT3A、DNMT3B的蛋白表达水平。6.EVO预防小鼠肺癌的发生和发展在乌拉坦腹腔注射诱导小鼠肺癌动物实验中,EVO能显著降低肺结节的发生率,5 mg/kg组抑制肺癌发生率28.57%,10 mg/kg组抑制率为34.50%,而各组体重、脏器指数并无显著性差异,表明EVO在小鼠体内无明显蓄积毒性;另外,HE染色观察乌拉坦能成功诱导小鼠肺部形成肿瘤,免疫组化结果显示Notch3蛋白表达下调。取肺结节提蛋白经 Western blot 检测,Notch3、ADAM9、γ-secretase complex 蛋白表达水平均降低,NUMB蛋白表达水平升高。结论:本文从体外研究了 EVO对Notch通路的作用及机制,发现EVO可能通过上调DNMTs的蛋白表达水平,促进Notch3启动子区域的DNA甲基化水平,表观遗传调控Notch3的蛋白表达,从而抑制Notch通路进展,抑制下游靶基因转录,从而阻滞细胞周期,抑制细胞增殖,降低肿瘤恶性程度。小鼠肺癌预防模型表明吴茱萸碱有效降低了肺结节发生率。综上所述,EVO可作为Notch3表观遗传修饰剂,抑制Notch通路激活,预防肺癌发生,为临床肿瘤治疗提供一定的理论依据。