为了解安徽省水生源人致泻性大肠杆菌(Aquatic pathogenic coli,APEC)的致病型状况,2017-2018年进行了大肠杆菌分离鉴定和致病型分析;为了解分离到的水生源人致泻性大肠杆菌各致病型突破哺乳动物肠道黏膜屏障的能力,进行了各致病型菌株混合口服攻毒试验;为了解肠聚集性大肠杆菌(Enteroaggregative Escherichia coli,EAEC)分型标志基因pic对大肠杆菌致病性的意义,应用CRISPR/Cas9基因编辑系统构建了pic缺失株,并研究了其基本的病理生物学特性。具体研究内容和结果如下:1、APEC的分离鉴定和致病型分析2017-2018年采集安徽省内病鱼、鱼肠内容物、鱼池水和沉积物、鸭(或猪)-渔养殖系统沉积物、病禽(鸡、鸭、鹅)、兔、羊、鼠、人的组织或粪便等生物样品,采用麦康凯及伊红美蓝选择培养基双重选择分离疑似大肠杆菌菌株,并利用16S rDNA测序进行鉴定;采用GB4789.6-2016方法基于标志性毒力基因谱进行人致泻性大肠杆菌分型。结果显示,共分离大肠杆菌76株。从猪、羊、兔、人等哺乳动物肛拭子分离到10株;从水禽、鸭、鹅、鸡等禽类的肛拭子或肝脏分离到53株;从石蛙、草鱼、鳊、光唇鱼、鳙、鲢等水生动物的肛拭子、肝、脾、脑或体表溃疡分离到10株;从池塘底泥及水分离到3株。非致病株有46株;人致泻性大肠杆菌有30株,其中肠道致病性大肠杆菌EPEC 4株;产肠毒素大肠杆菌ETEC 11株;肠道集聚性大肠杆菌EAEC 8株;肠道侵袭性大肠杆菌EIEC 7株。2、APEC对小鼠肠微生态的影响及其肠道致病性7株APEC(EAEC 2株、EPEC 3株、ETEC 1株及非致病型1株)等比例混合后给昆明系小鼠灌胃攻毒,观察了小鼠临床症状、剖检变化、对肠微生态影响、突破消化道黏膜屏障的能力。结果显示,在感染后24h及48h可从试验组小鼠的脾脏中分离到EAEC,且在感染后12h、24h及48h的肠道内容物基因组提取物中也可检测到EAEC,其毒力基因都与17J105相同。可以确定本实验室分离到的17J105株经口服途径可以造成小鼠肠炎和系统感染,并在7株分离株的致病性中具有优势。而通过高通量16S rDNA测序表明,APEC混合攻毒对小鼠结盲肠菌群多样性的影响主要集中在12h,停止灌胃后,其肠道微生态将逐渐趋于恢复到正常水平。3、鱼源EAEC 17J105株pic基因缺失对其病理生物学特性的影响运用CRISPR/Cas9系统构建了△pic基因缺失突变株。通过细菌动力学及世代数的测定,药敏试验、组织载菌量及半数致死量探索pic基因缺失对17J105生物学特性和毒力的影响。结果表明,缺失pic基因,可使世代时间延长、组织载菌量减少、半数致死量提高、对斑马鱼致死能力降低。△pic缺失株对新霉素、恩诺沙星、土霉素及环丙沙星的耐药性增加,而对阿奇霉素的耐药性减小。应用高通量16S rDNA测序技术检测分析分别用17J105菌株与pic缺失株口服攻击的小鼠结盲肠中肠道内容物的群落多样性变化。结果显示17J105菌株攻毒后小鼠结盲肠中的肠道内容物的群落多样性较对照组相比明显减少,pic缺失株的群落多样性较17J105的略有提高,但仍比对照组少。应用高通量RNA-Seq技术筛选出17J105和pic缺失株感染小鼠结盲肠组织的差异表达基因,进行了生物信息学分析,并利用荧光定量PCR验证了部分差异表达基因。野生株攻毒组与pic缺失株攻毒组相比筛选出的差异表达基因共有1 161个。功能注释结果显示差异表达基因主要参与转录及其调控等生物过程;细胞质、细胞膜及其整体组成;蛋白结合、金属离子结合等分子功能方面。KEGG通路分析得到的主要差异大都为与免疫和疾病相关的通路。荧光定量PCR结果与转录组测序结果基本吻合,说明了测序数据的可靠性。以上研究结果表明,APEC的致病型复杂,鱼源EAEC17J105株突破鼠肠黏膜屏障能力最强。EAEC17J105株的pic基因缺失减弱了其致病性、减弱了其对鼠肠微生态稳态的影响能力,pic基因参与了对肠免疫和疾病相关应答基因的调控。