基于C-di-GMP操纵的光响应系统及重复序列删除的定量研究

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环鸟苷二磷酸(c-di-GMP)是广泛存在于细菌中一种重要的第二信使分子,在铜绿假单胞菌中,主要参与细菌的运动粘附行为及生物被膜形成的调节。随着合成生物学特别是光响应系统的发展,以环鸟苷二磷酸为对象的相关应用型研究也越来越多。本文的第一部分主要以环鸟苷二磷酸为对象,通过设计构造了单色光响应和双色光响应两套系统,在利用单色光响应系统实现对单细菌的追踪操纵后,通过进一步的优化并建立双色光响应系统,利用静态图案化投影技术,经过对实验体系、实验条件的不断优化测试,最终实现了活细菌生物被膜的定向生物打印,并成功地实现了可逆的生物打印。由于工程菌种具有很强的可改造性,光响应系统的建立为研究新型抗菌表面、新型活细菌生物材料及其他应用领域提供了新的方法和思路。而本文的第二部分主要基于三色荧光报告系统设计了一套精准定量细胞内重复片段删除率的新方法,即三色荧光成像重复片段删除事件计数器(Three-color Fluorescent based Deletion Events Counter,TFDEC),经过聚合酶链式反应(PCR)以及进一步测序的方法验证了该系统的准确性。利用该系统建立的新方法,可以快速准确地定量细胞内重复序列删除率,通过对16组重组相关的突变株重复序列删除率的定量,发现rec A基因的缺失显著降低了铜绿假单胞菌中重复序列删除率,而uvr D和rad A基因的缺失则显著地提升了铜绿假单胞菌中重复序列删除率,但uvr Drec A和rad Arec A基因双缺失则将铜绿假单胞菌中重复序列删除率拉回到较低水平。这说明,在测量条件下,重复序列的删除是Rec A依赖型的,而Uvr D和Rad A刺激的重复序列删除会因为Rec A的失活而受到抑制。同时,利用该方法表征了铜绿假单胞菌中不同生理条件下的重复序列删除率,发现环丙沙星可以显著地提高铜绿假单胞菌内重复序列删除率,提高胞内cdi-GMP水平也同样能显著地提高铜绿假单胞菌内重复序列删除率。另外,利用该方法探究不同基因组结构对重复序列删除率的影响,发现在相同同源臂间距下,同源臂的序列长度越长,重复序列删除率则越高,在一定区间内,同源臂长度和重复序列删除率大小成指数关系,但是同源臂长度小于或大于一定数值时这种相关性则消失,通过建模完美地拟合了同源臂长度和重复序列删除率之间的关系,发现DNA的链交换过程是由熵驱动的,并且链交换的过程对碱基错配的容忍度很低,而不同同源臂间隔、不同基因组插入位置、不同培养时间以及不同启动子等条件对重复序列删除率的影响都没有显著性差异。
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