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羊泰勒虫病(Ovine Theileriosis)是一种梨形虫病，该病病原主要损害绵羊、山羊等小反刍兽的网状内皮系统细胞和红细胞。该病在全世界范围内流行，在中国，主要流行于西北、东北、西南等地区。无浆体病(Anaplasmosis)是蜱传性血液立克次体病，由无浆体属(Anaplasma)病原寄生于人和动物血细胞内引起。无浆体可感染牛、羊、鹿等反刍动物及人，引起从轻微至严重的红细胞内疾病。羊泰勒虫病和无浆体病均属于蜱传性疾病，可引起人和动物贫血、高热、消瘦和黄疸等临床症状，导致动物发育不良、消瘦、产肉量和产毛量减少，严重时导致死亡，严重危害人和动物健康，给养殖业带来巨大经济损失。吕氏泰勒虫（T.luwenshuni）和绵羊无浆体(A.ovis)对羊致病力强且流行范围广，其中A.ovis具有潜在人兽共患风险。T.luwenshuni和A.ovis的诊断中，血液涂片染色镜检检测病原检出率低且易漏诊，血清学检测方法存在假阳性等问题;聚合酶链式反应(PCR)检测方法有敏感性高、特异性强等优点，但其不仅操作要求高，且所需仪器设备较贵，不适用于病原的现场快速检测。本研究旨在创建敏感性高、特异性强的T.luwenshuni和A.ovis的RPA分子检测方法，以期为两种病原的临床病原检测和流行病学调查提供技术支持。
1.吕氏泰勒虫RPA检测方法的建立及应用
为创建快速、灵敏的重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)检测T.luwenshuni，根据T.luwenshuni18S rRNA基因序列(GeneBank序列号为MG799814.1)，使用Primer6.0软件结合NCBI-BLAST设计T.luwenshuni RPA检测技术的特异性引物，利用T.luwenshuni质粒DNA样品和RPA Basic试剂盒筛选出合适的T.luwenshuni RPA引物，然后进行反应体系和反应条件的优化、特异性、敏感性、重复性和临床样品检测试验，并将敏感性和临床样品检出率与传统PCR检测方法进行对比。结果显示，所创建的RPA方法能够扩增出409bp特异性T.luwenshuni特异性片段;与莫氏巴贝斯虫(Babesia motasi)、嗜吞噬细胞无浆体（A.phagocytophilum）、刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）、附红细胞体（Eperythrocyte ovis）、绵羊泰勒虫（T.ovis）和环形泰勒虫（Tannulata）质粒DNA无交叉反应;最低可检测出T.luwenshuni质粒DNA的浓度为3.5pg/μL;在25～45℃的反应温度下均可有效扩增;当引物浓度为10μM时，最低添加量为1.0μL。结果表明，本研究建立的T.luwenshuni RPA方法特异性强、重复性好，敏感性不足，需进一步优化，为快速、准确检测吕氏泰勒虫病的临床病原检测提供新的技术参考。
2.绵羊无浆体RPA检测方法的建立及应用
为创建快速、灵敏的重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)检测A.ovis，本研究根据绵羊无浆体MSP4基因(GenBank序列号MK087768.1)，利用Primer6.0软件结合NCBI-BLAST设计A.ovis特异性RPA引物，再对该方法的反应体系和反应条件进行优化，然后进行特异性、敏感性、重复性和临床样品检测试验，结果表明，所创建的RPA方法能特异性扩增出A.ovis的354bp目的片段;与吕氏泰勒虫（T.luwenshuni）、莫氏巴贝斯虫（B.motasi）、嗜吞噬细胞无浆体（A.phagocytophilum）、刚地弓形虫（T.gondii）、附红细胞体（E.ovis）、绵羊泰勒虫（T.ovis）和环形泰勒虫（T.annulata）质粒DNA没有交叉反应，最低可检测出A.ovis质粒DNA的浓度为2.5fg/μL;在25～45℃的反应温度下均可有效扩增;当引物浓度为10μM时，最低添加量为1.0μL。结果显示，创建的A.ovis RPA检测方法具备良好的特异性、敏感性和重复性。本研究创建的A.ovis RPA方法敏感性高、特异性强、重复性好，可为快速、准确检测无浆体病的临床病原检测提供新的技术支持。
1.吕氏泰勒虫RPA检测方法的建立及应用
为创建快速、灵敏的重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)检测T.luwenshuni，根据T.luwenshuni18S rRNA基因序列(GeneBank序列号为MG799814.1)，使用Primer6.0软件结合NCBI-BLAST设计T.luwenshuni RPA检测技术的特异性引物，利用T.luwenshuni质粒DNA样品和RPA Basic试剂盒筛选出合适的T.luwenshuni RPA引物，然后进行反应体系和反应条件的优化、特异性、敏感性、重复性和临床样品检测试验，并将敏感性和临床样品检出率与传统PCR检测方法进行对比。结果显示，所创建的RPA方法能够扩增出409bp特异性T.luwenshuni特异性片段;与莫氏巴贝斯虫(Babesia motasi)、嗜吞噬细胞无浆体（A.phagocytophilum）、刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）、附红细胞体（Eperythrocyte ovis）、绵羊泰勒虫（T.ovis）和环形泰勒虫（Tannulata）质粒DNA无交叉反应;最低可检测出T.luwenshuni质粒DNA的浓度为3.5pg/μL;在25～45℃的反应温度下均可有效扩增;当引物浓度为10μM时，最低添加量为1.0μL。结果表明，本研究建立的T.luwenshuni RPA方法特异性强、重复性好，敏感性不足，需进一步优化，为快速、准确检测吕氏泰勒虫病的临床病原检测提供新的技术参考。
2.绵羊无浆体RPA检测方法的建立及应用
为创建快速、灵敏的重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)检测A.ovis，本研究根据绵羊无浆体MSP4基因(GenBank序列号MK087768.1)，利用Primer6.0软件结合NCBI-BLAST设计A.ovis特异性RPA引物，再对该方法的反应体系和反应条件进行优化，然后进行特异性、敏感性、重复性和临床样品检测试验，结果表明，所创建的RPA方法能特异性扩增出A.ovis的354bp目的片段;与吕氏泰勒虫（T.luwenshuni）、莫氏巴贝斯虫（B.motasi）、嗜吞噬细胞无浆体（A.phagocytophilum）、刚地弓形虫（T.gondii）、附红细胞体（E.ovis）、绵羊泰勒虫（T.ovis）和环形泰勒虫（T.annulata）质粒DNA没有交叉反应，最低可检测出A.ovis质粒DNA的浓度为2.5fg/μL;在25～45℃的反应温度下均可有效扩增;当引物浓度为10μM时，最低添加量为1.0μL。结果显示，创建的A.ovis RPA检测方法具备良好的特异性、敏感性和重复性。本研究创建的A.ovis RPA方法敏感性高、特异性强、重复性好，可为快速、准确检测无浆体病的临床病原检测提供新的技术支持。