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目的:前期研究结果显示,恢复STGC3基因在CNE2细胞的表达,导致CNE2细胞放疗敏感性增强,细胞自噬减少,其机制仍未明了。本课题在前期工作基础上,测定CNE2各转染组细胞蛋白质表达差异情况,明确STGC3基因增强CNE2细胞放射敏感的分子机制。方法:1.构建STGC3基因稳定高表达质粒。2.脂质体转染CNE2细胞。实验分组:1)照射组:CNE2-RFP-STGC3细胞(高表达组),CNE2-RFP细胞(空载体组),CNE2细胞组,以6MV射线照射,每组照射剂量梯度为2Gy、4Gy、6Gy、8Gy。2)未照射组:CNE2-RFP-STGC3细胞、CNE2-RFP细胞及CNE2细胞组。3.显微镜下观察细胞形态学变化。4.Transwell实验,检测照射处理后各组细胞侵袭迁移能力。5.Western Blot方法,检测自噬相关蛋白Beclin1、barkor、vps34及凋亡相关蛋白Bcl-2表达水平。6.考马斯亮蓝染色及蛋白质质谱分析,分析各组细胞间蛋白质表达差异。结果:1.成功构建STGC3稳定高表达质粒。2.成功构建CNE2-RFP-STGC3及CNE2-RFP细胞系:1)荧光检测:荧光显微镜下可见CNE2-RFP-STGC3及CNE2-RFP组细胞表达红色荧光蛋白(RFP)数目均>90%。2)Western Blot检测:CNE2-RFP-STGC3组细胞STGC3蛋白表达量明显高于CNE2-RFP组及CNE2组,可用于后续实验。随后在南华大学附属第一医院放疗科完成照射组的细胞放射。3.随着照射剂量的增加(2Gy、4Gy、6Gy、8Gy),显微镜观察结果显示:照射组细胞均发生了典型的EMT形态学改变。4.Transwell迁移侵袭实验结果显示:经过放疗处理后,CNE2-RFP-STGC3组细胞迁移、侵袭细胞计数均低于各对照组,差异具有统计学意义(p<0.05)。5.Western Blot结果显示:经照射后,CNE2-RFP-STGC3组细胞,自噬相关蛋白Beclin1、barkor、vps34,凋亡相关蛋白Bcl-2表达水平均降低(p<0.05),差异具有统计学意义(p<0.05)。6.考马斯亮蓝染色及蛋白质质谱分析、Mascot数据库鉴定,结果显示:Heat shock 70 kDa protein 1A,Phosphoglycerate kinase 1在实验组的表达量低于对照组,60 kDa heat shock protein,mitochondrial在实验组的表达量高于对照组。结论:1.STGC3基因高表达,CNE2细胞放疗敏感性增强,可能与细胞自噬减少及凋亡增加有关。2.CNE2细胞STGC3基因高表达,可使III型PI3K-Beclin1、PGK-1、Hsp70及Bcl-2蛋白质表达降低,Hsp60蛋白质表达增强,导致细胞自噬减少,凋亡增加。