基于蛋白修饰激活天然产物的生物合成途径及C3-芳香型吡咯并吲哚生物碱的组合生物合成

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本文主要分为两部分:1)通过对Sfp型磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(phosphopantetheinyl transferases,PPTase)的过表达,激活“沉默”基因簇,进而挖掘新的天然产物;2)解析 Streptomyces sp.CMB-MQ030 中 Naseseazine A,B(NAZ-A,NAZ-B)的生物合成机制,确定关键酶,然后利用这些关键酶,构建出高效的全细胞催化体系用于催化合成吡咯并吲哚生物碱。天然产物对新药的发现和发展至关重要。然而大量的天然产物的生物合成路径在实验室条件下处于“沉默”状态,从而限制了天然产物的发现。目前,在微生物天然产物合成过程包括基因组、转录组、蛋白组和代谢组水平挖掘天然产物的策略已取得巨大成功。本研究中我们发现通过提高保守蛋白载体蛋白(carrier protein,CP)的翻译后修饰-磷酸泛酰巯基乙胺化可以高效的调节天然产物的生物合成。将两个底物宽泛的PPTase基因在体内过表达,结果发现33株重组菌株中有23株的次级代谢产物谱发生了较为显著的变化,产生了新的化合物峰或化合物的产量显著提高,有效率高达70%。对两株重组菌株进行大量发酵,分离得到7个化合物,其中2个新化合物。本研究发展了一种基于蛋白合成酶的修饰激活“沉默”基因簇挖掘天然产物的新方法,此方法有助于天然产物的发现和研究。C3-芳香型吡咯并吲哚是一大类重要的天然产物,普遍具有优异的生理活性;但目前缺乏高效、统一的构建和拓展分子骨架的方法,限制了对该家族化合物的药学和生物学的研究。本研究通过解析S.sp.CMB-MQ030中NAZ-A和NAZ-B的合成机制,确定了环二肽合酶(CDPS)和细胞色素p450酶(NAZ-p450)是NAZ-A和NAZ-B合成途径中的关键酶。然后将NAZ-p450和菠菜来源的ferrodoxin/ferrodoxin reductase组合构建了全细胞催化体系,利用该体系对化学合成的20种含有色氨酸的环二肽进行催化,最后得到27个C3-芳香型吡咯并吲哚类化合物。利用这样的化学-酶法合成的思路,不仅可以突破天然环二肽的结构局限,还能克服化学合成C2-C3手性叔碳和季碳中心的瓶颈,实现此类复杂吡咯并吲哚生物碱骨架多样性的快速、高效制备,为该生物碱家族药学和生物学研究奠定坚实的基础。
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