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法氏柴胡宽蛾Depressaria falkovitshi Lvovsky作为本课题组在2013年发现的中国新纪录种,是我国柴胡种植区的一种优势害虫,主要以幼虫取食危害柴胡种子、嫩叶、茎尖和花蕾,虫害大发生时危害率可达90%,严重影响了柴胡的产量和品质。由于其繁殖力强、自然天敌少且具有卷叶习性等特点难以防治。研究法氏柴胡宽蛾的气味结合蛋白有助于深入了解昆虫的嗅觉机制,可进一步研究法氏柴胡宽蛾与寄主植物的关系,进而为研发相关的引诱剂、趋避剂等新型药剂提供新思路。为此,本研究利用法氏柴胡宽蛾转录组数据,通过生物信息学和分子生物学相结合的方法,从法氏柴胡宽蛾中克隆了2个气味结合蛋白基因,并对其进行了体外表达,测定了它们的表达谱。主要研究结果如下:1.结合法氏柴胡宽蛾成虫转录组数据分析并利用RT-PCR技术,本研究成功克隆得到两个气味结合蛋白基因DfalOBP1(GenBank登录号:MG882075)和DfalOBP3(GenBank登录号:MG882077)。DfalOBP1基因开放阅读框长420bp,编码139个氨基酸,N-末端包含18个氨基酸组成的信号肽,预测蛋白分子量大小为16.22kDa。该蛋白具有典型的气味结合蛋白的结构特征,6个保守的半胱氨酸残基形成3个二硫键,属于Classical OBP。DfalOBP3基因开放阅读框长399bp,编码132个氨基酸,N-末端包含16个氨基酸组成的信号肽,预测蛋白分子量大小为14.97kDa。该蛋白包含4个保守的半胱氨酸残基,联结形成2个二硫键,属于Minus-C OBP。通过同源搜索(BLAST)发现,法氏柴胡宽蛾DfalOBP1与黑脉金斑蝶Danaus plexippus DpleOBP1、稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis CmedGOBP2的氨基酸序列一致性最高,达到82.64%。DfalOBP3与烟草天蛾Manduca sexta MsexABP8的氨基酸序列一致性最高,达到83.19%。将得到的两个基因,构建到pET-30a(+)表达载体中,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达,SDS-PAGE结果显示DfalOBP1和DfalOBP3均在15-25kDa之间有一条明显的条带。2.本研究选取EF1、RPL10、RPL32、RPS20、28S rRNA作为候选内参基因,利用qRT-PCR技术分别比较了法氏柴胡宽蛾不同发育阶段和成虫不同组织中各候选内参基因的表达情况。通过GeNorm、NormFinder和BestKeeper 3种软件对各候选内参基因进行稳定性评价,结果显示,在法氏柴胡宽蛾不同发育阶段,最稳定的候选内参基因为RPS20和RPL10。在成虫不同组织中,最稳定的候选内参基因为RPS20。因此,本研究认为RPS20可以作为法氏柴胡宽蛾不同发育阶段和成虫不同组织定量试验时的内参基因。3.利用qRT-PCR技术,检测了DfalOBP1和DfalOBP3基因在法氏柴胡宽蛾雌雄成虫不同组织中的表达量。结果显示,两个基因主要在成虫头部表达,且在雌虫头部的表达量显著高于雄虫,在其他组织中少量表达或几乎不表达。该结果表明DfalOBP1和DfalOBP3可能在法氏柴胡宽蛾定位寄主植物和寻找产卵场所过程中发挥重要作用。