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固定化金属螯合亲合色谱法(IMAC)是近20年发展起来的一项新型分离技术,常规的金属螯合亲合介质多以葡聚糖或琼脂糖等软基质作为载体,但这些介质机械强度小稳定性差,难以用于加压体系而限制了其在大规模蛋白质分离纯化中的应用规模和效率。而聚苯乙烯系树脂由于具有原料来源广泛、价廉且易功能化等优点,引起了人们的注意,但是聚苯乙烯系载体具有强疏水性,因此一般在载体上引入亲水性间隔臂,以增强相应金属螯合树脂的亲水性。常用的间隔臂有环氧基、二胺基等。
为此本文以氯乙酰聚苯乙烯(PS-Acyl-C1)为载体分别引入乙二胺(EDA)和己二胺(HMD)得到两种胺基树脂(PS-Acyl-EDA和PS-Acyl-HMD),该方法可以克服氯甲基化树脂制备过程中的弊端,且制备的胺基树脂可以作为一个活性中间体,进一步衍生化制备多种功能介质。
以PS-Acyl-EDA为载体,使用氯乙酰氯将其活化,之后固载亚胺二乙酸功能基团,合成了聚苯乙烯型亚胺二乙酸树脂。优化了亚胺二乙酸用量、反应时间、反应温度及NaOH的浓度等条件对聚苯乙烯型亚胺二乙酸树脂的影响,最佳反应条件为:IDA用量为氯乙酰基的7.5倍(摩尔比)、NaOH浓度25%,60℃下反应24小时。
以PS-Acyl-EDA作为载体,与环氧氯丙烷(ECH)反应制得环氧化聚苯乙烯树脂,再固载L-苯丙氨酸(L-Phe)制得聚苯乙烯型苯丙氨酸树脂。考察了溶剂体系、NaOH用量、L-Phe用量、反应温度、反应时间等条件对苯丙氨酸聚苯乙烯树脂的影响,结果表明:以水作为溶剂、Phe:NaOH:环氧基=10:10:1、100℃下反应12-18小时,可得到担载量为0.842 mmol·g-1的聚苯乙烯型苯丙氨酸树脂。
将聚苯乙烯型苯丙氨酸树脂和聚苯乙烯型亚胺二乙酸树脂螯合金属镍离子(Ni2+),分别得到聚苯乙烯型苯丙氨酸镍树脂和聚苯乙烯型亚胺二乙酸镍树脂,以醛糖还原酶融合蛋白为对象,初步考察了聚苯乙烯型苯丙氨酸镍树脂(PS-Phe-Ni2+)和聚苯乙烯型亚胺二乙酸镍树脂(PS-IDA-Ni2+)在纯化融合蛋白中的应用。将不经过硫酸铵沉淀、透析等预处理的粗酶液,直接用于亲合纯化,简化了纯化工艺,且聚苯乙烯型苯丙氨酸镍树脂经过二次吸附洗脱之后,由SDS-PAGE结果表明,可得到单一条带;聚苯乙烯型亚胺二乙酸镍树脂在粗酶液中加入5 mM咪唑进行吸附洗脱,得到的蛋白比酶活为30.66 U/mg,纯化倍数达到15倍。由此可以说明制备的两种聚苯乙烯型镍树脂可较好的纯化融合蛋白,且操作简单、周期短,有望在融合蛋白纯化方面具有良好的应用前景。