蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus,B.cereus）是一种机会致病菌,可引起食源性疾病,主要症状是呕吐和腹泻。除此之外,对于免疫功能低下甚至免疫功能正常的人群,蜡样芽孢杆菌还可引起局部或全身性的非胃肠道感染。这些非胃肠道感染包括菌血症,肺炎,眼内炎,中枢神经系统感染等。在有些情况下,蜡样芽孢杆菌感染甚至会引起患者死亡,特别是对于出现菌血症的患者死亡率会更高。乳糖三糖糖苷脂（Globotriaosylceramide,Gb3）,又被称为CD77,是一种重要的细胞表面分子,可以与多种病原体组分结合,如志贺毒素,大肠杆菌P型菌毛,猪链球菌Fhb,铜绿假单胞菌的凝集素I（Lec A）等,在多种细菌感染过程中发挥重要作用。尽管Gb3在不同病原体感染期间发挥的功能不尽相同,我们推测Gb3可能是多种细菌共用识别受体,但是Gb3在蜡样芽孢杆菌感染过程中是否发挥作用,以及如果发挥作用其作用机制是什么尚不清楚。为了回答以上科学问题,我们利用Gb3缺失小鼠建立蜡样芽孢杆菌小鼠腹腔感染模型,发现Gb3促进了蜡样芽孢杆菌导致的急性感染。之后筛选鉴定出了蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白可以与Gb3结合。粘附实验证明了蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白与Gb3的相互作用有助于蜡样芽孢杆菌粘附。利用蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白敲除株和抗鞭毛蛋白抗体,通过小鼠体内实验发现,在Gb3存在的情况下,鞭毛蛋白参与了蜡样芽孢杆菌感染小鼠的过程,并且抗鞭毛蛋白抗体具有免疫保护作用,最后我们还对鞭毛蛋白与Gb3结合后可能影响的信号通路进行了初步研究。本研究主要实验内容和结果包括以下三部分。一、Gb3促进了蜡样芽孢杆菌导致的急性感染为了探究Gb3在蜡样芽孢杆菌HN001感染小鼠中的作用,我们利用Gb3缺失小鼠建立蜡样芽孢杆菌小鼠腹腔感染模型,结果发现,Gb3缺失小鼠的死亡率、脏器细菌载量和血清内细胞因子IL-1β,IL-6、TNFα均显著低于野生型小鼠,这说明Gb3促进了蜡样芽孢杆菌导致的急性感染。为了研究蜡样芽孢杆菌分泌的毒力因子对蜡样芽孢杆菌感染的影响,我们构建了毒力因子表达受到抑制的蜡样芽孢杆菌菌株HN001-Δplc R。然后再分别用HN001和HN001-Δplc R菌株及其培养菌液上清去感染小鼠,发现蜡样芽孢杆菌分泌的毒力因子是导致小鼠急性死亡的直接原因。然后,我们用HN001培养菌液上清分别注射野生型和Gb3缺失小鼠,两种小鼠均发生急性死亡,但之前实验用HN001感染野生型和Gb3缺失小鼠时Gb3缺失小鼠死亡率较低,这表明分泌型毒力因子介导的小鼠死亡可能并不是直接通过Gb3发挥作用。所以,我们推测蜡样芽孢杆菌某种表面成分与宿主细胞Gb3之间发生了相互作用。之后我们测定了蜡样芽孢杆菌对野生型和Gb3缺失型h CMEC/D3细胞的粘附能力,结果发现蜡样芽孢杆菌可能通过Gb3实现了粘附,这表明可能某种蜡样芽孢杆菌表面成分与宿主细胞Gb3之间发生了相互作用。二、蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白与宿主细胞表面Gb3的相互作用Gb3作为细胞表面分子,可以嵌入细胞膜脂双层结构,但亲水的寡糖链可暴露在细胞膜外侧。Gb3的寡糖链包含Galα1-4Gal（galabiose）二糖结构,是多种病原体成分的结合位点。我们将含有Galα1-4Gal二糖结构的鸽卵类粘蛋白标记到磁珠上来钓取与之结合的蜡样芽孢杆菌表面蛋白,之后利用质谱技术鉴定出了蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白可能是与Gb3结合的配体,并利用生物膜层表面干涉技术测定亲和常数进行了验证。然后利用流式细胞技术证明了蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白可以与细胞表面Gb3结合,并通过扫描电子显微镜和激光扫描共聚焦显微镜观察蜡样芽孢杆菌可通过鞭毛粘附到细胞表面。为了研究蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白与Gb3的相互作用,我们构建了蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白敲除株HN001-Δfla,并且利用Gb3合成抑制剂,鞭毛蛋白,Lec A,二糖Galα-4Gal处理进行粘附实验,结果发现HN001-Δfla组、处理组与对照组相比蜡样芽孢杆菌粘附能力显著降低,这说明鞭毛蛋白与细胞表面Gb3结合有助于蜡样芽孢杆菌的粘附。为了进一步探究鞭毛蛋白与Gb3的相互作用对蜡样芽孢杆菌感染小鼠的影响,我们分别用HN001和HN001-Δfla感染野生型小鼠和Gb3缺失小鼠。结果发现,对于野生型小鼠,HN001-Δfla感染组小鼠的死亡率、脏器细菌载量和血清中IL-1β,IL-6、TNFα水平均显著低于HN001感染组小鼠;而对于Gb3缺失小鼠,HN001-Δfla感染组与HN001感染组小鼠结果没有显著差异。这些结果说明在Gb3存在的情况下,鞭毛蛋白参与了蜡样芽孢杆菌感染小鼠的过程。目前被动抗体治疗已被用于治疗多种细菌感染性疾病,抗体的作用靶标包括细菌分泌的毒力因子和细菌表面分子,抗细菌抗体发挥作用方式之一就是抑制细菌的粘附。在本研究中,我们用蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白免疫新西兰兔,获取抗鞭毛蛋白血清,并纯化出抗鞭毛蛋白抗体。通过蜡样芽孢杆菌小鼠腹腔感染模型,探究抗鞭毛蛋白抗体对小鼠的保护作用,结果显示,抗鞭毛蛋白抗体处理组小鼠死亡率,脏器细菌载量和血清中IL-1β、IL-6和TNFα水平均显著降低,这表明抗蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白抗体可以缓解蜡样芽孢杆菌对小鼠的感染,在蜡样芽孢杆菌感染小鼠过程中起到保护作用。三、蜡样芽孢杆菌鞘磷脂酶作用机制初步研究鉴于已发现蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白可以与Gb3结合,我们对鞭毛蛋白与Gb3结合后可能影响的信号通路进行了初步研究。文献报道大肠杆菌P型菌毛、志贺毒素与细胞表面Gb3结合后会使细胞神经酰胺含量显著升高,进而激活TLR4信号通路;重组表达的蜡样芽孢杆菌鞘磷脂酶Bc-SMase可以水解宿主细胞表面的鞘磷脂从而使神经酰胺含量升高,所以我们推测蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白与Gb3结合后,可能通过其产生的Bc-SMase水解细胞表面鞘磷脂从而产生神经酰胺。因此我们构建了Bc-SMase敲除株HN001-Δsmase,并发现蜡样芽孢杆菌感染细胞时Bc-SMase可以使细胞神经酰胺水平明显升高,并且此过程是依赖于Gb3的存在,这说明其可能是通过Bc-SMase使神经酰胺升高从而激活相关信号通路介导宿主炎症反应,但还有待于进一步研究证实。在本研究中我们发现了Gb3可以促进蜡样芽孢杆菌导致的急性感染,筛选鉴定出了蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白可以与Gb3结合,并且这种相互作用有助于蜡样芽孢杆菌粘附。除此之外还发现鞭毛蛋白与Gb3的相互作用可能还参与了蜡样芽孢杆菌对小鼠的感染过程,抗鞭毛蛋白抗体在蜡样芽孢杆菌感染小鼠过程中能够起到保护作用。最后,我们还对鞭毛蛋白与Gb3结合后可能影响的信号通路进行了初步研究,发现其可能通过Bc-SMase使神经酰胺升高从而激活相关信号通路。总之,本研究除了证明蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白与Gb3的相互作用之外,还为蜡样芽孢杆菌感染的防治提供了有价值的信息。