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实验背景:神经胶质瘤是颅内最常见的原发型恶性肿瘤,严重威胁人类健康,发生机制尚不完全清楚。肿瘤抑制基因启动子区CpG岛高甲基化所致的基因沉默在肿瘤发生中是一种最基础的表观遗传学事件,也是肿瘤中最普遍的肿瘤抑制子失活机制之一。去甲基化药物可逆转基因的甲基化修饰,抑制肿瘤生长。Wnt通路在肿瘤细胞中常异常活化,是肿瘤发生发展过程中的重要事件。该通路的异常激活既可能是由Wnts及其受体复合物、通路中一种或几种成份过表达或突变所致,也可能是由Wnt通路胞外抑制子基因失活或表达降低而导致。实验目的:本研究从基因水平分别分析胶质瘤组织和胶质瘤细胞系中Wnt信号通路胞外抑制子基因启动子区甲基化情况,研究Wnt通路抑制子在胶质瘤发生发展中的作用,同时研究去甲基化药物对胶质瘤细胞的作用,为去甲基化药物应用于胶质瘤的治疗提供研究依据。实验方法:甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCR, MSP)分析胶质瘤组织和胶质瘤细胞系A172、U251中Wnt通路抑制子SFRP1、SFRP2、SFRP5、DKK1及WIF-1基因启动子区CpG岛的甲基化;使用去甲基化药物5-Aza-2′-deoxycytidine(ADC)和去乙酰化酶抑制剂Trichostatin A(TSA)共同作用于胶质瘤细胞,半定量RT-PCR分析药物处理前后SFRP1、SFRP2、SFRP5、DKK1及WIF-1基因以及Wnt/β-catenin下游靶基因CCND1的mRNA表达水平;MTT法测定药物作用前后胶质瘤细胞的增殖能力;软琼脂集落形成实验检测胶质瘤细胞克隆形成能力。实验结果:1. MSP对Wnt信号通路抑制子SFRP1、SFRP2、SFRP5、DKK1、WIF-1启动子区CpG岛甲基化分析结果显示:与对照组相比,53例神经胶质瘤组织中,上述5个抑制基因在45例组织样本中至少有1个基因启动子区高甲基化(83%),WHOII级胶质瘤中占18/19(94.74%),WHOIII级胶质瘤中占15/22(68.18%),WHOIV级胶质瘤中占10/12(83.33%);SFRP1、SFRP2、SFRP5、DKK1与WIF-1在肿瘤组织中发生甲基化的比例分别为43.40%, 28.30%, 26.42%, 66.04%, 13.21%。其中,SFRP1在WHOII、III级中的比例分别高于WHOIV级(II:P<0.01,III:P<0.05);SFRP5在WHOII中的甲基化比例明显高于在WHOIII、IV级中的比例(III +IV:P<0.05),SFRP2、DKK1、WIF-1在各个级别均有明显甲基化,但无统计学差异。总体来讲,在组织样本中,这5个抑制基因甲基化程度随着肿瘤级别的升高而逐渐降低,其中高级别肿瘤(WHOIII、IV级)中的甲基化比例明显低于WHOII级(P<0.05)。胶质瘤细胞系A172、U251中,Wnt通路抑制子SFRP1、SFRP2、SFRP5、DKK1和WIF-1启动子区均高甲基化。2. RT-PCR半定量分析显示:在对照组中,两种细胞系中SFRP1低水平表达,DKK1表达水平较高,其余三个抑制子基因几乎不表达;使用甲基化药物处理后,A172细胞中SFRP1和SFRP2表达水平增高(P<0.05);SFRP5和WIF-1表达显著升高(P<0.01);DKK1与对照相比表达水平略有降低,但无统计学意义(P>0.05)。U251细胞中SFRP1、SFRP2和WIF-1的mRNA表达水平显著升高(P<0.01),SFRP5的表达与对照组相比明显升高(P<0.05);DKK1的表达也有所增加,但无统计学意义(P>0.05)。3.去甲基化药物可使胶质瘤细胞A172中Wnt/β-catenin的靶基因CCND1表达水平下调(P<0.05),在胶质瘤细胞U251中有类似结果,CCND1的mRNA表达水平显著降低(P<0.01)。4. MTT法测定表明,去甲基化处理可以明显抑制神经胶质瘤细胞U251、A172的增殖能力。软琼脂细胞集落实验结果显示,去甲基化处理可以明显抑制神经胶质瘤细胞U251、A172的集落形成能力。结论:1.胶质瘤组织和胶质瘤细胞系A172、U251中,Wnt通路抑制基因SFRP1、SFRP2、SFRP5、DKK1和WIF-1的启动子区存在明显的高甲基化修饰。2.去甲基化药物可使胶质瘤细胞系A172、U251中Wnt信号通路抑制基因SFRP1、SFRP2、SFRP5和WIF-1的表达增加,使Wnt/β-catenin靶基因CCND1表达下调;表明在胶质瘤细胞中,去甲基化药物可通过增加SFRPs和WIF-1的表达抑制Wnt信号的异常活化。3.去甲基化药物对胶质瘤细胞A172、U251中DKK1的表达没有明显影响。4.去甲基化药物能抑制胶质瘤细胞的增殖能力和集落形成能力。